鼠疫是流行在啮齿动物间的自然疫源性疾病，其病原体是鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌，Yersinia pestis)。生物群落中鼠疫菌和宿主、媒介之间保持着相对的生态平衡，其中鼠疫菌对宿主是有害的，但它并不能消灭宿主整个种群，其传播也是有限的^[1]。鼠疫流行期具有敏感性的宿主动物体内鼠疫菌急剧增加，常常从中分离到鼠疫菌，而间歇期从自然宿主中难以检测到典型鼠疫菌或者仅仅检测到非典型鼠疫菌^[2]。鼠疫菌常规的检测方法包括微生物学技术、噬菌体裂解试验、抗原组分Ⅰ的免疫学检测和经典的动物试验^[3]，其中微生物学技术对鼠疫菌的典型形态起着辅助诊断作用。目前自动化仪器和分子生物学技术在细菌鉴定中广泛应用，但是细菌培养后形态学检查方法仍然发挥着重要作用。携带鼠疫噬菌体的鼠疫菌是鼠疫监测与控制工作中的特殊现象^[4-5]，本文通过描述携带鼠疫噬菌体的鼠疫菌培养特性和形态，为准确快速诊断鼠疫疑难病原体和鼠疫教学指导工作奠定基础。

携带鼠疫噬菌体的2株鼠疫菌(编号：天峻02号和污染的川a003号)由青海省地方病预防控制所鼠疫菌专业实验室提供。

随机选择体质量为18~20 g健康昆明系小白鼠，由青海省实验动物中心提供。

赫氏琼脂培养基由青海省地方病预防控制所鼠疫菌专业实验室培养基室制备；抗鼠疫噬菌体血清由青海省地方病预防控制所鼠疫预防控制室制备。

OLYMPUS CX21FS1双筒显微镜，由青海省地方病预防控制所鼠疫菌专业实验室提供。

携带鼠疫噬菌体的鼠疫菌(编号：天峻02号)菌株经平板划线法和/或抗鼠疫噬菌体血清平板28 ℃ 24~72 h培养，在光学显微镜下观察菌群形态和菌落形态；携带鼠疫噬菌体的鼠疫菌(编号：川a003号)菌株经动物实验联合平板划线法和/或抗鼠疫噬菌体血清平板28 ℃ 24~72 h培养，在光学显微镜下观察菌群形态和菌落形态。

经28 ℃48 h培养，浓厚的菌群培养区菌苔呈黄褐色，透过普通光线呈灰白色且带淡青色，菌落较湿润。

形态较完整者，经28 ℃48 h培养形成肉眼可见的圆形小菌落，透过普通光线呈灰白色且带淡青色，反射光线呈淡灰白色，菌落较湿润。镜下观察发现其边缘呈暗褐色，中心有光泽且稍突出，ϕ0.10~0.20 mm。不典型菌落较正常菌落色淡，ϕ 0.05~0.10 mm，整个菌落粗糙颗粒分布不均匀，部分菌落噬菌侧颗粒减少，非噬菌侧颗粒较多，个别菌壁破裂者出现粗糙颗粒释放迹象(图 1A)。另外，部分菌落呈空壳状，隐约可见粗糙颗粒(图 1B)。培养72 h后，菌苔变稀薄的区域呈现大片不规则拉丝状噬菌斑，进而出现散在的单个小菌落，其噬菌程度和大小均不同。

图 1 不同培养方式下携带鼠疫噬菌体的鼠疫菌群和菌体形态(×10) Figure 1 Colonial and cellular morphology of Yersinia pestis carrying bacteriophages under different cultivation conditions (×10 times)

图选项

随着噬菌体的逐渐侵入，圆形菌落1/3外层呈现冰晶状或者树枝状，2/3内层中心呈花絮状。噬菌体对菌落进一步侵蚀，圆形菌落1/3中心颗粒逐渐减少或消失，2/3外层呈倒插的毛刺，整个呈“空壳菌落”，即用接种环从琼脂表面刮取进行24~48 h培养后平皿上未见菌落生长。见图 1C、D。

污染的川a003号菌株用0.9%生理盐水制成菌悬液0.50 ml。分别在2只小白鼠左鼠蹊部皮下注射上述菌悬液0.20、0.30 ml，每天观察和饲养小白鼠。对接种第2天死亡的小白鼠解剖，取其肝、脾、肺、心、淋巴5种脏器组织分别压印培养于赫氏琼脂培养基，28 ℃ 24 h培养。

28 ℃ 24 h小白鼠脾部培养物形成肉眼可见的数十个零散针尖大小的圆形小菌落，透过普通光线呈灰白色且带淡青色，菌落较湿润。继续培养48 h后，镜下观察发现不典型菌落较正常菌落色淡，ϕ0.05~0.10 mm，菌落中心粗糙颗粒分布不均匀，其中部分菌落噬菌侧颗粒逐渐减少或消失，说明川a003号菌株经动物实验后分离的菌株仍然携带鼠疫噬菌体。另外还有个别菌落其边缘呈暗褐色，中心有光泽且稍突出，ϕ 0.10~0.20 mm。挑取暗褐色较典型菌落经抗鼠疫噬菌体血清处理后的赫氏琼脂培养基反复培养2次，分离出正常的鼠疫菌，且鼠疫噬菌体裂解试验为阳性。经动物实验后川a003号菌株在镜下未见污染菌生长。

应用平板划线法和/或抗鼠疫噬菌体血清技术后，2株鼠疫菌在赫氏琼脂培养基上经28 ℃ 24 h培养形成肉眼可见的圆形小菌落。透过普通光线菌落呈灰白色且带淡青色，反射光线呈淡灰白色。镜下观察发现其边缘呈暗褐色，中心有光泽且稍突出，ϕ0.10~0.20 mm。培养48 h后菌落增大，ϕ3.00~4.00 mm，中心棕黄色，边缘半透明而带灰白色。培养更久的菌落通过镜下观察可看出略有数层的微细构造，中心较致密，颜色较暗且不透明，边缘较薄而透明。微调显微镜可清楚看到薄而透明不整齐的花边分布在菌落突出部位的周围，菌落中心粗糙颗粒呈起伏的小丘状。整个菌落呈黄色或黄褐色，略显干燥(图 1E、F)。

微生物的培养通常是借助人工配制的培养基和人为创造的培养条件，使其快速生长繁殖。微生物分离的最简单方法是平板划线法，细菌在固体培养基上的培养特征就是菌落特征，主要包括颜色、大小、形状、数目、质地、透明度等。细菌形态学包括细菌细胞形态学和细菌菌落形态学。正确的形态学检验结果是对细菌进行准确鉴定的坚实基础^[6]。尽管目前先进仪器的使用改善了传统细菌学鉴定的薄弱环节，但是传统的形态学鉴定是必不可少的。微生物学检验工作中细菌的形态学检验主要体现在细菌培养后显微镜下的直观观察^[6]。通过显微镜可以进一步认识生物体的生命活动规律。

本研究2个现场样本中噬菌体与鼠疫菌间处于一种稳定的平衡状态，即携带状态^[7]。这种特殊的培养物既含有正常鼠疫菌，又有携带鼠疫噬菌体的菌落，镜下观察发现非典型菌落较正常鼠疫菌小，其生长缓慢，用接种环从琼脂表面刮取“空壳菌落”进行24~48 h培养后平皿上未见菌落生长。该培养物制成菌悬液攻击动物，死亡动物的脏器培养物中仍含有噬菌体的非典型菌落。因此，实验室经常利用抗鼠疫噬菌体血清平板法培养携带鼠疫噬菌体的鼠疫菌，通过光学显微镜观察鼠疫菌菌落形态和菌群形态，从而分离出正常鼠疫菌。动物鼠疫流行末期，基层业务人员在鼠疫检测和疫情判定的过程中往往容易漏检这种特殊菌株，从而对疫情判断有延误的可能性，因此此种“异常现象”应引起高度重视。

鼠疫菌作为鼠疫的病原体，其培养法是鼠疫诊断的“金标准”。本研究通过肉眼和光学显微镜观察携带鼠疫噬菌体的鼠疫菌菌落形态和菌群形态，该方法简单、快速、直观、经济，对鼠疫疑难病原体的鉴定和实验室微生物学技术指导工作具有重要价值。