中国媒介生物学及控制杂志  2020, Vol. 31 Issue (6): 657-661

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姚丹丹, 姜洪雪, 隋晶晶, 冯志勇
YAO Dan-dan, JIANG Hong-xue, SUI Jing-jing, FENG Zhi-yong
抗凝血杀鼠剂选择压力下黄毛鼠抗药性相关解毒酶的研究
A study on detoxifying enzymes related to the resistance of Rattus losea to anticoagulant rodenticides under its selective pressure
中国媒介生物学及控制杂志, 2020, 31(6): 657-661
Chin J Vector Biol & Control, 2020, 31(6): 657-661
10.11853/j.issn.1003.8280.2020.06.006

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收稿日期: 2020-07-08
抗凝血杀鼠剂选择压力下黄毛鼠抗药性相关解毒酶的研究
姚丹丹 , 姜洪雪 , 隋晶晶 , 冯志勇     
广东省农业科学院植物保护研究所, 植物保护新技术重点实验室, 广东 广州 510640
摘要: 目的 探讨抗凝血杀鼠剂选择压力下黄毛鼠抗药性与代谢解毒酶的关系,为阐明黄毛鼠抗药性机制奠定基础。方法 采用酶标仪分别检测黄毛鼠血清和肝脏中相关解毒酶细胞色素P450(CYP450)、NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)、细胞色素b5(Cytb5)的含量和活性,并进行不同类群间的比对分析,分析这种差异和抗药性水平的相互关系。结果 在广东省江门市黄毛鼠种群中,无论是敏感鼠还是抗药性鼠,肝脏中解毒酶的含量及活性均高于血清中的含量和活性,其中肝脏中NQO1的含量和活性、Cytb5的含量在敏感鼠和抗药性鼠之间差异均有统计学意义(t1=2.408,P1=0.037;t2=2.515,P2=0.031;t3=2.281,P3=0.046),且敏感鼠高于抗药性鼠,而血清中3种酶的含量和活性、肝脏中CYP450的含量和活性以及Cytb5的活性差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论 3种酶中仅肝脏NQO1的含量和活性、Cytb5的含量与黄毛鼠的抗药性相关,推测鼠类对抗凝血类杀鼠剂的抗药性是一个多因素协同作用的结果,应将多个因素结合在一起进行综合分析,才能更好地阐明鼠类对抗凝血剂的抗药性作用机制。
关键词: 黄毛鼠    抗药性    细胞色素P450    NAD(P)H醌氧化还原酶1    细胞色素b5    
A study on detoxifying enzymes related to the resistance of Rattus losea to anticoagulant rodenticides under its selective pressure
YAO Dan-dan , JIANG Hong-xue , SUI Jing-jing , FENG Zhi-yong     
Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, Guangdong Province, China
Abstract: Objective To explore the relationship between the resistance of Rattus losea and its metabolic detoxifying enzymes under the selective pressure of anticoagulant rodenticides, and to lay a foundation for elucidating the resistance mechanism. Methods A microplate reader was used to determine the contents and activities of cytochrome P450 (CYP450), NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1), and cytochrome b5 (Cytb5) in serum and liver of R. losea; meanwhile, comparative analyses were performed between different populations for the relationship of the difference with resistance level. Results The content and activity of detoxifying enzymes in liver were higher than those in serum in both sensitive and resistant R. losea populations in Jiangmen, Guangdong province, China. The content and activity of NQO1 and the content of Cytb5 in liver were significantly higher in the sensitive rodents than in the resistant rodents (t1=2.408, P1=0.037; t2=2.515, P2=0.031; t3=2.281, P3=0.046). However, there were no significant differences in the contents and activities of the three enzymes in serum, the content and activity of CYP450 in liver and the activity of Cytb5 (all P>0.05). Conclusion Among the three enzymes, only the content and activity of NQO1 and the content of Cytb5 in the liver are related to the insecticide resistance of R. losea. It is speculated that the resistance of rodents to anticoagulant rodenticides is a synergistic effect of multiple factors. Therefore, a comprehensive analysis of multiple factors should be performed to better clarify the mechanism of action of rodents' resistance to anticoagulant rodenticides.
Key words: Rattus losea    Insecticide resistance    Cytochrome P450    NAD(P)H quinone oxidoreductase 1    Cytochrome b5    

鼠类的抗药性可分为行为抗性、生理抗性和遗传抗性。行为抗性是害鼠对药物食入量不足而不能呈现预期效果,并非严格意义上的抗性[1];遗传抗性的产生通常是由基因突变引起的[2-3];生理抗性也叫代谢抗性,其化学本质是杀鼠剂代谢活性的增强,归因于代谢相关酶在数量或质量上的改变。生物体对药剂的代谢抗性与羧酸酯酶(carboxylesterases,CarEs)、细胞色素P450酶系(cytochrome P450,Cyt-P450)和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GSTs)这3大类超基因家族密切相关[4]。Cyt-P450是主要存在于肝细胞内微粒体内质网膜上的氧化酶系,它是一个多酶复合体,主要由细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)、细胞色素b5(cytochrome b5,Cytb5)和NADPH-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochrome P450 reductase,CPR)组成,它们共同组成电子传递体系[5]。Cyt-P450是生物体内脂肪酸、生物碱、激素等内源化合物以及药物、植物毒素、杀虫剂、杀鼠药剂等外源性化合物的重要代谢系统,CYP450在其中起着中心作用[6]。Cytb5为Cyt-P450的组成部分之一,是一个具有多种重要生理功能的低自旋金属蛋白,作为呼吸链系统的主要电子传递体,Cytb5与CYP450紧密结合形成1:1的蛋白质复合物,诱导CYP450自旋状态由低到高的改变,并增加其与底物的亲和力,从而增加其代谢活性[7]。NAD(P)H醌氧化还原酶1〔NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1〕是真核细胞内普遍存在的一类黄素蛋白酶,它专性催化细胞内双电子还原反应,能够保护细胞不被自然界中的醌类等生物异源性物质所损伤。NQO1在哺乳动物的各个器官均有表达,以肝脏含量最为丰富[8]

黄毛鼠(Rattus losea)是广东省重要的农业有害生物和病媒生物,占农田害鼠总数的40%~70%,可造成各种农作物减产10%~30%,局部的粮油作物甚至失收[9]。广东省从20世纪80年代开始大规模灭鼠,特别是珠江三角洲地区,每年灭鼠3~4次,由于抗凝血杀鼠剂的长期大量使用以及不科学的灭鼠方法,致使黄毛鼠对第一代抗凝血剂如杀鼠醚、敌鼠钠盐等普遍产生了抗药性[10],严重影响了治理效果。目前已针对该鼠的敏感基线、抗药性检测方法、抗药性发生动态和抗性机制等开展了较多的研究[11-14],但在抗药性解毒酶的研究方面仍是空白。本研究分别检测黄毛鼠血清和肝脏中抗药性相关解毒酶(CYP450、NQO1、Cytb5)的含量和活性,并进行不同类群间的比对分析,进一步分析这种差异和抗药性水平的相互关系,为阐明黄毛鼠抗药性的作用机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

黄毛鼠于2018年12月捕自广东省江门市野外农田,带回室内单笼饲养适应1周以上,选择健康、非孕、亚成年以上的试鼠供试。CYP450、NQO1和Cytb5的含量和活性测定试剂盒购自广州春畅生物技术开发有限公司。

1.2 方法 1.2.1 黄毛鼠血清和肝脏样品的采集

每只试鼠称重、鉴定性别、编号,采用致死期食毒法(LFP)进行抗药性检测[10],将抗药性检测过程中出血症状明显、活动迟缓、濒临死亡的试鼠视为敏感鼠,处死后断头取血,室温静置一段时间后3 000 r/min(离心半径13.5 cm)离心20 min。收集上清液保存于-20 ℃冰箱备用,同时解剖取肝脏组织1 g以上,保存于-80 ℃冰箱备用;按同样方法采集抗药性检测后存活鼠的血清和肝脏,试验过程中共获得6只敏感鼠和10只抗药性鼠,分别采集了12份敏感鼠样品和20份抗药性鼠样品。

1.2.2 黄毛鼠血清和肝脏中抗药性相关解毒酶的含量和活性测定

从冰箱取出肝脏样品,称量约1 g肝脏组织,加入9 ml磷酸盐缓冲液(PBS),同时加入液氮进行研磨,5 000 r/min(离心半径13.5 cm)离心15 min,取上清液按照试剂盒说明书的操作步骤进行操作,血清样品经解冻后直接按照试剂盒的使用说明进行操作,采用酶标仪测定血清和肝脏中抗药性相关酶的含量和活性,分析比较敏感和抗药性鼠酶的含量和活性差异。

1.3 统计学分析

试验数据采用Excel 2007、SPSS 19.0软件进行处理和分析,采用独立样本t检验进行不同类群间黄毛鼠抗药性相关酶的含量和活性比较,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 不同类群黄毛鼠CYP450的含量和活性测定

敏感黄毛鼠血清和肝脏中CYP450的含量分别为(226.31±7.22)和(300.20±13.76) pmol/L,抗药性黄毛鼠血清和肝脏中CYP450的含量分别为(230.24±5.33)和(288.88±7.47) pmol/L,经检验,敏感与抗药性鼠血清和肝脏中CYP450的含量差异无统计学意义(t1=-0.437,P1=0.671;t2=0.723,P2=0.491)。见图 1

图 1 广东省江门市黄毛鼠细胞色素P450含量的测定结果 Figure 1 Test results of cytochrome P450 content in Rattus losea in Jiangmen, Guangdong province

在CYP450的活性方面,敏感黄毛鼠血清和肝脏中分别为(24.71±0.87)和(33.36±1.52) IU/L,抗药性黄毛鼠血清和肝脏中CYP450的活性分别为(24.57±0.78)和(32.24±0.48) IU/L,经检验,敏感和抗药性鼠血清及肝脏中CYP450的活性差异均无统计学意义(t1=0.122,P1=0.905;t2=0.699,P2=0.511)。见图 2

图 2 广东省江门市黄毛鼠细胞色素P450活性的测定结果 Figure 2 Test results of cytochrome P450 activity in Rattus losea in Jiangmen, Guangdong province
2.2 不同类群黄毛鼠NQO1的含量和活性测定

敏感黄毛鼠血清和肝脏中NQO1的含量分别为(81.13±2.56)和(107.06±3.09) ng/L,抗药性黄毛鼠血清和肝脏中NQO1的含量分别为(84.41±3.03)和(97.84±2.26) ng/L,经检验,敏感和抗药性黄毛鼠血清中NQO1的含量差异无统计学意义(t=-0.826,P=0.428),而肝脏中NQO1的含量差异有统计学意义(t=2.408,P=0.037)。见图 3

注:a. t=2.408, P=0.037。 图 3 广东省江门市黄毛鼠NAD(P)H醒氧化还原酶1含量的测定结果 Figure 3 Test results of NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 content in Rattus losea in Jiangmen, Guangdongprovince

在NQO1的活性方面,敏感黄毛鼠血清和肝脏中NQO1的活性分别为(261.34±10.01)和(364.02±8.54) mIU/L,抗药性黄毛鼠血清和肝脏中NQO1的活性分别为(279.12±10.30)和(335.69±7.35) mIU/L,经检验,敏感和抗药性黄毛鼠血清中NQO1的活性差异无统计学意义(t=-1.238,P=0.244),而肝脏中NQO1的活性差异有统计学意义(t=2.515,P=0.031)。见图 4

注:a.t=2.515, P=0.031。 图 4 广东省江门市黄毛鼠NAD(P)H醒氧化还原酶1活性的测定结果 Figure 4 Test results of NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 activity in Rattus losea in Jiangmen, Guangdongprovince
2.3 不同类群黄毛鼠Cytb5的含量和活性测定

敏感黄毛鼠血清和肝脏中Cytb5的含量分别为(27.63±0.61)和(36.43±0.65) nmol/L,抗药性黄毛鼠血清和肝脏中Cytb5的含量分别为(27.50±0.86)和(33.89±0.90) nmol/L,经检验,敏感和抗药性黄毛鼠血清中Cytb5的含量差异无统计学意义(t=0.125,P=0.903),而肝脏中Cytb5的含量差异有统计学意义(t=2.281,P=0.046)。见图 5

注; a.t=2.281, P=0.046。 图 5 广东省江门市黄毛鼠细胞色素b5含量的测定结果 Figure 5 Test results of cytochrome b5 content in Rattus losea in Jiangmen, Guangdong province

在Cytb5的活性方面,敏感黄毛鼠血清和肝脏中Cytb5的活性分别为(51.76±0.69)和(69.75±1.07) U/L,抗药性黄毛鼠血清和肝脏中Cytb5的活性分别为(50.53±1.93)和(68.43±2.15) U/L,经检验,敏感和抗药性黄毛鼠血清及肝脏中Cytb5的活性差异均无统计学意义(t1=0.601,P1=0.561;t2=0.552,P2=0.593)。见图 6

图 6 广东省江门市黄毛鼠细胞色素b5活性的测定结果 Figure 6 Test results of cytochrome b5 activity of Rattus losea in Jiangmen, Guangdong province
3 讨论

研究结果表明,在广东省江门市黄毛鼠种群中无论是敏感鼠还是抗性鼠,肝脏中解毒酶的含量及活性均高于血清中的含量和活性,其中肝脏中NQO1的含量和活性、Cytb5的含量在敏感鼠和抗药性鼠之间差异有统计学意义,且敏感鼠高于抗药性鼠,而血清中3种酶的含量和活性、肝脏中CYP450的含量和活性以及Cytb5的活性差异均无统计学意义。

抗凝血类杀鼠剂对鼠类的作用机制主要是通过阻止鼠类的维生素K循环,导致凝血功能障碍。在维生素K循环中,维生素K环氧化物还原酶(vitamin K epoxide reductase,VKOR)可以将氧化型的维生素K还原为还原型维生素K,随后维生素K依赖的凝血因子和蛋白在γ-谷氨酰羧化酶(γ-glutamyl-carboxylase,GGCX)的作用下,利用还原型维生素K将谷氨酸残基转变为γ-羧基谷氨酸,在此过程中还原型维生素K就变为氧化型的维生素K。杀鼠灵等抗凝血类杀鼠剂与维生素K的基本化学结构相似,可以与维生素K循环中的VKOR相结合,阻止还原型维生素K的生成,从而阻止凝血因子的活化导致凝血功能障碍[15]。Pelz等[2]和Wajih等[16]研究提出了NAD(P)H依赖的维生素K还原途径:抗药性鼠为了维持γ-羧化效率,关闭VKOR还原途径,同时开启NAD(P)H还原途径,该途径涉及到NQO1和NAD(P)H脱氢酶等。相对于VKOR而言,NQO1对抗凝血剂并不敏感,Markussen等[17]研究发现NQO1基因的表达量和活性在抗药性鼠中低于敏感鼠,本研究结果与此类似,推测VKOR补充途径主要依赖NAD(P)H脱氢酶。

除了VKOR、NQO1、NAD(P)H脱氢酶与鼠类的抗药性相关外,Cyt-P450参与抗凝血类杀鼠剂在鼠体内的代谢,杀鼠灵可以选择性地被CYP450酶催化生成4′-、6-、7-、8-和10-羟基化杀鼠灵,这些代谢产物能够随着尿液或粪便排出体外,从而降低有毒物质对机体的损害[18]。Takeda等[19]研究发现日本屋顶鼠(R. rattus)对杀鼠灵的抗药性主要通过增加P450基因的表达促进杀鼠灵的代谢,其中敏感鼠和抗药性鼠Cyp2b1Cyp2c6Cyp2c11Cyp3a2基因的表达量有显著差别,在抗性鼠的血清中检测到更低水平的杀鼠灵,而在尿液中则检测到更多的羟基化杀鼠灵。同样,在英国的褐家鼠(R. norvegicus)种群中,CYP450对杀鼠剂的代谢活动增强,能够解释不同地理种群相同的VKORC1基因突变而抗药性水平差异有统计学意义,在西北部褐家鼠的肝脏中能检测到更多的羟基化鼠得克[20]。本研究中CYP450的含量和活性在敏感鼠和抗药性鼠之间差异无统计学意义,可能是由于CYP450是一个复杂的基因家族,整体的含量和活性差异不大,但该家族中部分亚家族的关键基因在表达量和活性上存在差异,从而影响CYP450酶的代谢功能。而Cytb5作为CYP450的协同作用因子,其基因的表达量变化即含量可能与鼠类对杀鼠灵的抗药性相关。

鼠类对抗凝血类杀鼠剂的抗药性是一个复杂的生理过程,一方面是抗凝血杀鼠剂的作用靶标酶VKOR发生遗传变异,导致抗凝血剂的抑制作用下降;另一方面是解毒系统对杀鼠剂的代谢作用增强;此外,钙腔蛋白(calumenin,CALU)作为一种拮抗信号肽,可以与VKOR结合从而阻断杀鼠灵与VKOR的结合[17],CALU、NQO1、NAD(P)H脱氢酶、Cytb5、NAD(P)H P450还原酶等也可能与鼠类的抗药性相关[21];另外,抗凝血杀鼠剂进入肠道后,肠道微生物菌群产生的化合物能与药物结合,改变药物的结构从而使药物化学性质改变,导致鼠类产生抗药性[22]。因此,在抗凝血剂抗药性的研究中,应将多个因素结合在一起进行综合分析,甚至考虑另外的维生素K补充途径,才有可能更好地阐明鼠类对抗凝血剂的抗药性作用机制。

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