布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人畜共患的变态反应性传染病，在我国广泛流行，特别是畜牧业发达地区，内蒙古自治区(内蒙古)是历史疫区^[1]，作为该地区3个盟之一的阿拉善盟近几年布病发病有所增加，但本地区布病临床病例、病原学检测与监测，分子生物学研究鲜见报道。内蒙古阿拉善盟中心医院自引进法国生物梅里埃公司VITEK2以来，极大地提高了布鲁氏菌的检测与布病的诊断能力，本研究分析了2015－2019年内蒙古阿拉善盟人间布病流行特征，并对布鲁氏菌分离株进行基因分型，探讨菌株间流行病关联，分析布鲁氏菌分离株的分子流行病学特征。

医院门诊采集就诊患者血液，注入需氧血培养瓶和厌氧血培养瓶，放入血培养仪中培养，将血培养瓶报警阳性标本，分别转种于羊血琼脂平板、巧克力和中国兰血琼脂平板，5% CO₂温箱培养，将培养的菌落用细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司VITEK2及配套革兰阴性鉴定卡GN)进行鉴定，阿拉善盟中心医院2015－2019年经血培养确诊为布病病例23例，包括巴润别立镇4例、巴彦诺尔公苏木1例、巴彦浩特镇4例、巴彦木仁苏木8例，吉兰泰镇屠宰场、腾格里苏木和吉兰泰镇各1例，另3例不详，主要为农牧民及屠宰场工人等。所有患者均签定知情同意书，同意采集血液进行诊断试验。

病原学鉴定主要是根据菌落染色、形态、生长特性、单项特异性血清A/M凝集试验，H₂S产生试验、CO₂需求试验，双层琼脂法噬菌体(TB和BK₂)裂解(RTD)试验、染料硫堇/碱性复红抑菌试验等进行布鲁氏菌种/型鉴定。布鲁氏菌抗体检测应用血清试管凝集试验(SAT)^[2]。

试验用参考菌株共8株，分别为羊种生物1~3型，牛种生物1和2型，猪种生物1~3型，参考菌株和临床分离菌株转种于布鲁氏菌斜面培养基，37 ℃培养48 h，挑取适量对数生长期的布鲁氏菌菌落，使用500 μl无菌去离子水将其混匀，80 ℃ 2 h灭活细菌后，按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明提取核酸DNA，-20 ℃冻存备用。

多重PCR方法鉴定布鲁氏菌种与生物型^[3]，每批次PCR试验，均需设立阳性和阴性对照，阳性对照模板DNA为参考菌株DNA，阴性对照为不加任何DNA的反应体系。

根据文献[4]，选择布鲁氏菌的16个串联重复序列位点进行PCR扩增，PCR扩增产物送生工生物工程(北京)股份有限公司进行测序，获取PCR扩增产物片段大小，按照文献[4]换算各个位点的重复单元数，利用BioNumerics 6.6软件对16个位点进行聚类分析，同时选取其他省份的布鲁氏菌菌株的MLVA资料进行比较分析^[5]。

23例病例中牧民占30.43%(7/23)，农民占39.13%(9/23)，干部、个体经营者、屠宰场工人和学生各1例，男女性别比例为3:1，发病年龄在16~66岁，平均年龄53岁。血清布鲁氏菌抗体阳性18例，其中94.44%患者抗体滴度＞1:200。

3 d后血培养瓶阳性标本报警，吸取100 μl培养液分别转种于羊血琼脂平板、巧克力和中国兰血琼脂平板，5%CO₂温箱培养，羊血琼脂平板和巧克力平板生长有大小0.5 mm，圆形、光滑、凸起、透明、边缘整齐的菌落。中国兰血琼脂平板不生长。镜下可见革兰阴性小球杆菌，多数成双排列，偶有单个。将培养的菌落用细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司VITEK2及配套革兰阴性鉴定卡GN)进行鉴定，细菌鉴定仪提示布鲁氏菌生化反应中，47种反应酶中有3种阳性(proA、tyrA、URE)。

23株临床分离布鲁氏菌菌株，H₂S产生试验阴性、CO₂需求阴性，染料硫堇/碱性复红抑菌试验皆阳性，单项特异性血清A和M凝集试验皆阳性，噬菌体BK2能够裂解，噬菌体TB不裂解，23株菌株皆为羊种布鲁氏菌生物3型。

23株临床分离布鲁氏菌菌株，多重PCR鉴定结果见图 1，阳性和阴性对照成立，23株电泳条带大小为218、278和766 bp，根据参考标准菌株电泳结果及文献，23株皆为布鲁氏菌羊种生物3型菌株。

注; 1、34.为相对分子质量10 bp DNA Marker; 2~24.为23株临床分离菌株电泳图, 自下而上依次为218, 278和76b bp。25~32.为参考菌株电泳图, 依次为羊种生物l型(泳道25).羊种生物2型(泳道26).羊种生物3型(泳道27).牛种生物1型(泳道28).牛种生物2型(泳道29).猪种生物1型(泳道30).猪种生物2型(泳道31).猪种生物3型(泳道32);33.为阴性对照。 图 1 多重PCR鉴定23株临床分离布鲁氏菌菌株和8株参考菌株电泳图谱 Figure 1 Electrophoresis profile of Brucella strains (23 clinical isolates identified by multiplex PCR assay and 8 reference strains)

图选项

MLVA分析发现，23株临床分离菌株与参考菌株与羊种布鲁氏菌生物3型亲缘关系最近，23株菌株中有13个位点(bru06、bru07、bru08、bru09、bru11、bru12、bru18、bru21、bru30、bru42、bru43、bru45和bru55)完全一致，bru19位点有2株菌株为23，其他均为20，而2个位点bru04和bru16则存在着多态性。依据位点bru04、bru16和bru19，23株菌株又可分为3大组：A组、B组、C组，尽管不同地区的菌株有交叉，但是分离自巴彦木仁苏木的菌株主要集中在A组内，来自吉兰泰镇的2株菌株集中在B组内。见图 2。

注:图中A, B和C分别为23株临床分离株聚类分析为3个组(3种不同颜色背景标记)。REF.为参考菌株; 其他为临床分离菌株; MLVA.多位点串联重复序列分析。 图 2 图内蒙古阿拉善盟地区23株临床分离菌株和l9株参考标准菌株MLVA聚类分析结果 Figure 2 MLVA cluster analysis plot of the 23 clinical isolates from Alxa league, Inner Mongolia and 19 standard reference strains

图选项

将阿拉善盟地区与文献报道的中国分离600株布鲁氏菌MLVA聚类分析，23株菌株皆属于羊种Cluster A1组内^[5]，该组菌株是中国的主要流行羊种基因型。23株中7株与宁夏菌株相关；7株与辽宁菌株相关；5株与浙江菌株相关，且基因型相似度非常高；3株与广东菌株相关；2株与山东菌株相关，2株与上海菌株相关。见表 1。

表 1 内蒙古阿拉善盟地区23株菌株与其他地区分离菌株的近缘关系 Table 1 Phylogenetic relationship between the 23 strains from Alxa league, Inner Mongolia and strains isolatedfrom other regions

表选项

阿拉善盟地处内蒙古最西部，南、东南与宁夏回族自治区毗邻，西、西南与甘肃省接壤，北与蒙古国交界。巴彦浩特镇东距北京市1 131 km，距呼和浩特市723 km，东南至银川市114 km，距西安市817 km，西南至兰州市520 km。阿拉善盟2018年牲畜存栏102.6万头(只)，占内蒙古地区的0.80%，良种牲畜比重为71.60%。阿拉善盟是畜牧业为主的地区，具有悠久的历史，牧民延续着半定居、半游牧的生活方式，对布病的检测主要以血清学检测为主，随着医疗器械的引进，科学技术的发展，近几年阿拉善盟临床医院逐渐地重视病原学检测，2015－2019年共检测出23株布鲁氏菌，均为羊种布鲁氏菌生物3型菌株。

从职业、年龄和接触史等流行病学调查结果看，牧民以及与牲畜密切接触的农民是布病的主要患者，是布病的高危人群，建议将布病病原学检测纳入布病疫区门诊检测的必查项目。

MLVA(16个位点)是目前布鲁氏菌分子流行病学研究的主要方法^[4-6]。MLVA可将布鲁氏菌16个位点分为3组，分别命名为panel l、panel 2A和panel 2B，panel 1组的8个位点(bru06、bru08、bru11、bru12、bru42、bru43、bru45和bru55)高度保守，适合布鲁氏菌在种水平上的鉴别，panel 2A组的3个位点(bru18、bru19和bru21)相对保守，panel 1和panel 2A组合，适用于遗传关系较近的同种(或生物型)菌株的鉴别，可用于分析流行菌株之间的差异和遗传关系^[7]，而panel 2B组不同菌株之间高度可变，适合暴发菌株间的溯源^[8-9]。而此次的23株菌株16个位点中有14个位点几乎完全一致，包括panel 1、panel 2A的11个位点(除2株菌株bru19为23，其他为20之外)，以及panel 2B中的2个位点(bru06、bru08)。23株菌株在种水平上MLVA基因型具有100%的同源性，而在菌株间具有差异性。

依据畜牧业的分布规律，以及牲畜消费由北向南、由西向东的发展^[10-11]，23株布鲁氏菌与其他地区菌株之间的近缘关系为：①阿拉善盟(包括内蒙古)-辽宁；②阿拉善盟(包括内蒙古)-山西-山东-广东；③阿拉善盟(包括内蒙古)-山西-浙江(上海)，②和③与文献上报告的Line 1(内蒙古-山东-广东)和Line 2(内蒙古-山西-浙江、上海)的菌株走向一致^[5]。阿拉善盟的所有菌株与其临近的甘肃省菌株没有亲缘关系。从分子流行病学分析菌株间的相关性，阿拉善盟地区分离的菌株与山西、山东、辽宁、浙江、上海和广东省(直辖市)，特别是辽宁、广东和浙江省分离的菌株关系密切，应作为布病宿主监测的主要对象。

阿拉善盟作为良种牲畜主要基地，其布病病原体检测与监测具有重要意义，检测、监测不到位，会导致患病良种牲畜的扩散，引起更大的疫情。