中国媒介生物学及控制杂志  2020, Vol. 31 Issue (5): 536-539
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甘肃省地处黄土高原、内蒙古高原和青藏高原的交汇地带，境内存有3处鼠疫自然疫源地, 即祁连山-阿尔金山高山草原喜马拉雅旱獭(Marmota himalayana)鼠疫自然疫源地、甘南高寒草甸草原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地和陇中黄土高原阿拉善黄鼠(Spermophilus dauricus alashanicus)鼠疫自然疫源地, 分布于10个县(区)的96个乡(镇), 面积达80 198.72 km2。自1959年判定甘肃省夏河县为鼠疫自然疫源地以来, 动物间疫情持续流行, 局部地区有暴发流行, 人间疫情呈上升趋势[1]。进人21世纪, 甘肃省共发生4起人间鼠疫疫情, 分别是2004年5月在肃南县、2007年9和11月在肃北县、2010年6月在阿克塞县和2014年7月在玉门市。这4起人间疫情都集中在祁连山-阿尔金山高山草原旱獭鼠疫疫源地, 均是由于主动接触旱獭等染疫动物引起[2-3]。随着交通的日益发达和人流交往的频繁, 大大增加了该地区鼠疫远距离传播的风险, 鼠疫防控形势严峻。为此, 作者对甘肃省鼠疫疫源地分离的46株鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)进行了抗菌药物的敏感性研究, 以便为当地的鼠疫防控策略提供科学依据和理论支持。
1 材料与方法 1.1 菌株来源实验菌株为甘肃省鼠疫自然疫源地内分离的46株鼠疫菌, 质控菌株为大肠埃希菌标准菌株ATCC25922, 均由青海省地方病预防控制所提供。
1.2 试剂与仪器琼脂粉、牛肉粉、可溶性淀粉、酸水解酪蛋白购自北京中生瑞泰科技有限公司; 赫氏培养基购自北京陆桥有限公司; 氧氟沙星、环丙沙星、磺胺甲恶唑.甲氧苄啶硫酸卡那霉素、硫酸链霉素、头孢曲松钠、氨苄西林.氣霉素、盐酸壮观霉素、头孢呋辛钠和盐酸四环素均购自北京中生瑞泰科技有限公司。HMI-60 & 24多点接种仪(天津市恒奥科技发展有限公司), DEN-IB细胞密度计(英国Grant bio), Proto COL3全自动菌落计数仪(英国synbiosis)。
1.3 方法按照美国临床和实验室标准化协会(Clinical Laboratory Standard Institution，CLSI) 2017-M100推荐, 采用琼脂平板稀释法测定抗菌药物对鼠疫菌的最低抑菌浓度(minimalinhibitory concentration, MIC)。
1.3.1 抗菌药物储备液配制氧氟沙星、环丙沙星和磺胺甲恶唑3种药物先加1/2体积无菌蒸馏水, 然后逐滴加入1 mol/L NaOH至溶解后, 再用无菌蒸馏水定容, 3种药物均配制成浓度为10mg/ml的储备液, 硫酸卡那霉素、硫酸链霉素.头孢曲松钠、氨苄西林、盐酸壮观霉素和头孢呋辛钠6种药物直接用无菌蒸馏水为溶剂溶解, 均配制成浓度为10 mg/ml的储备液, 盐酸四环素用无菌蒸馏水为溶剂溶解, 配制成浓度为5mg/ml的储备液, 氯霉素用95%乙醇溶液为溶剂溶解, 配制成浓度为10 mg/ml的储备液，甲氧苄啶用无菌蒸馏水加10%终体积的0.05 mol/L盐酸, 配制成浓度为2.50 mg/ml的储备液储存于-20 C冰箱中。
1.3.2 培养基用无菌蒸馏水将11种药物的储备液稀释成一定的浓度, 加入到已灭菌的定量Mueller-Hinton琼脂培养基中，制备成抗菌药物终浓度为0.004、0.008、0.015、0.031. 0.062、0.125、0.25. 0.50.1.00.2.00、4.00、8.00、16.00、32.00、64.00 μg/ml的含药平皿。
1.3.3 细菌接种将被试菌接种至北京赫氏平皿, 28C培养24h, 用无菌盐水制备成107CFU/ml的菌液, 吸取150μl制备好的菌液至灭菌96孔板孔内，记录所加菌株编号, 每批样本中均接种大肠埃希菌标准质控菌株ATCC25922。使用多点接种仪接种细菌, 接种针接种的菌液为1μl, 接种菌量约为104CFU, 接种前先接种不含抗菌药物的质控平皿以检查接种菌的生长性纯度, 随后从抗菌药物浓度最低的平皿开始依次接种不同浓度的抗菌药物，最后再接种1个不含抗菌药物的质控平皿, 以检验在接种过程中有无污染。将接种的培养皿置37 C温箱培养24~48 h。
1.3.4 结果观察判读终点时，平皿应置于不反光的表面上。质控菌株的MIC在质控范围内时, 记录完全抑制细菌生长的MIC, 并用全自动菌落计数仪进行拍照留存。单个菌落或接种物所致的轻微不清晰现象不必考虑。
2 结果 2.1 鼠疫菌抗药性测定46株鼠疫菌中未发现对氧氟沙星、环丙沙星、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑、硫酸卡那霉素、硫酸链霉素、头孢曲松钠、氨苄西林、氯霉素、盐酸壮观霉素、头孢呋辛钠和盐酸四环素具有单个或多个抗菌药物抗性的鼠疫菌株。根据CLSI标准, 46株被试菌株对上述抗菌药物均敏感，见表 1。
11种抗菌药物对鼠疫菌的体外抑菌活性以头孢曲松钠的抑菌活性最高(MIC90, 0.03 μg/m), 其次分别是环丙沙星(MIC90, 0.06 μug/ml), 甲氧苄啶-磺胺甲恶唑(MIC90, 0.12 μg/ml), 氧氟沙星(MIC90, 0.25 μg/ml), 氨苄西林(MIC90, 0.50 μg/ml), 头孢呋辛钠(MIC90, 1.00 μg/ml), 硫酸卡那霉素、硫酸链霉素、盐酸四环素和氯霉素的MIC90均为4.00 μg/ml, 盐酸壮观霉素的抑菌活性在11种抗菌药物中最低(MIC90, 16.00 μg/ml), 见表 1。
3 讨论鼠疫在历史上曾给人类造成无数次灾难, 自抗生素发明及逐步应用以后, 人类对治疗鼠疫才有了根本性的进展, 鼠疫患者在获得及时治疗的情况下死亡率大大降低。虽然以链霉素为代表的传统抗生素疗法在治疗细菌感染方面仍起着举足轻重的作用, 但越来越多的事实表明, 耐药率不断上升的问题正日益引起人们的重视[4]。国外已发现具有抗药性质粒带有多重耐药基因的鼠疫菌株[5-7]。迄今为止，虽然国内鼠疫临床上尚未发现这种耐药菌株, 但鼠疫是我国的甲类传染病, 也是潜在的生物恐怖菌剂(A类)[8-11], 一旦有耐药菌株出现并波及人间, 对鼠疫的控制将非常棘手[12]。
本研究选用临床常用抗菌药物头孢曲松钠、头孢呋辛钠、氨苄西林、氧氟沙星、环丙沙星、卡那霉素、链霉素、壮观霉素、盐酸四环素、氯霉素及预防性药物甲氧苄啶-磺胺甲恶唑对甘肃省鼠疫疫源地分离的46株鼠疫菌进行了最低抑菌浓度测定。结果显示，所有被试菌株均未发现对以上11种抗菌药物具有单个或多个抗菌药物抗性的鼠疫菌株; 头孢曲松钠的抗菌活性最高, 其次是环丙沙星.甲氧苄啶-磺胺甲恶唑和氧氟沙星, 壮观霉素的抗菌活性在11种抗菌药物中最低, 此结果与国外研究的鼠疫菌的MIC结果一致[13-14]。本次研究中尚未检测到耐药菌株, 但耐药质粒能够在细菌之间传递, 随着抗生素的大量应用, 携带耐药质粒的细菌越来越多, 加上基因突变产生的耐药菌株, 耐药性鼠疫菌出现的可能性也越来越大。细菌耐药问题在某种程度上不仅降低药物的治疗效果, 而且可在同种菌株内产生多重耐药性, 这会给细菌性疾病的预防和治疗带来新的挑战[15]。鉴于甘肃省鼠疫自然疫源地面积大、范围广, 动物间疫情处于活跃期，今后应将鼠疫菌耐药检测纳人常规监测工作中, 以便为有效治疗鼠疫患者提供参考, 同时也为制定精细化的鼠疫防控策略提供有效的科学依据。
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表1(Table 1)
