中国媒介生物学及控制杂志  2020, Vol. 31 Issue (5): 521-525

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杨瑞军, 黄世腾, 吕磊, 曹国平, 游佳玲, 万圣
YANG Rui-jun, HUANG Shi-teng, LYU Lei, CAO Guo-ping, YOU Jia-ling, WAN Sheng
浙江省衢州市2019年本地登革热暴发疫情的分子流行病学研究
Molecular epidemiological study of local dengue outbreak in Quzhou, Zhejiang province, China, 2019
中国媒介生物学及控制杂志, 2020, 31(5): 521-525
Chin J Vector Biol & Control, 2020, 31(5): 521-525
10.11853/j.issn.1003.8280.2020.05.004

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收稿日期: 2020-04-10
浙江省衢州市2019年本地登革热暴发疫情的分子流行病学研究
杨瑞军 , 黄世腾 , 吕磊 , 曹国平 , 游佳玲 , 万圣     
衢州市疾病预防控制中心微生物检验科/传染病防治科, 浙江 衢州 324000
摘要: 目的 对2019年衢州市本地登革热暴发疫情中检出的登革病毒1型进行序列测定和分子特征分析。方法 采集患者血清标本,采用胶体金免疫层析法和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法分别检测登革病毒NS1抗原和病毒核酸;采用RT-qPCR方法扩增登革病毒E基因后进行序列测定,并与不同国家和地区的登革病毒株进行同源性和进化树分析。结果 从患者血清标本中检测到登革病毒NS1抗原和病毒核酸,经基因序列比对及进化分析,8株登革病毒均为登革1型的基因Ⅰ型,与JF960228(2010年新加坡分离株)互为姐妹群,且毒力位点1处发生变异。结论 从病原学、血清学和分子生物学证实该起暴发疫情是由登革1型病毒引起,该毒株有可能来源于东南亚,应加强中国与该地区登革热跨境传播的防控。
关键词: 本地病例    登革热    登革病毒    E基因    序列分析    生物信息学    
Molecular epidemiological study of local dengue outbreak in Quzhou, Zhejiang province, China, 2019
YANG Rui-jun , HUANG Shi-teng , LYU Lei , CAO Guo-ping , YOU Jia-ling , WAN Sheng     
Quzhou City Center for Disease Control and Prevention, Quzhou 324000, Zhejiang Province, China
Abstract: Objective To determine the nucleic acid sequence of the dengue type 1 virus (DENV-1) detected in the local dengue outbreak in Quzhou, Zhejiang province, China, 2019, and to analyze its molecular characteristics. Methods Serum samples were collected from dengue patients; colloidal gold immunochromatographic assay and quantitative real-time PCR (RT-qPCR) were used to detect the NS1 antigen and nucleic acid of dengue virus, respectively. The RT-qPCR assay was used to amplify the envelope gene of dengue virus, which was then sequenced. The genotype of the isolated strains was analyzed, and the homology and phylogenetic analyses were performed with the dengue strains isolated from other countries and regions. Results The serum samples of patients were positive for the NS1 antigen and nucleic acid of dengue virus. The gene sequence alignment and phylogenetic analysis showed that 8 dengue virus strains all belonged to DENV-1 subgenotype GI, which had the closest phylogenetic relationship with the strain JF960228 (Singapore, 2010), with a mutation at virulence locus 1. Conclusion It was confirmed by etiology, serology, and molecular biology that the local dengue outbreak was caused by DENV-1, which may originate from Southeast Asia. It is necessary to strengthen the prevention and control of cross-border spread of dengue fever in China and this region.
Key words: Local case    Dengue fever    Dengue virus    Envelope gene    Sequence analysis    Bioinformatics    

登革热是由登革病毒(Dengue virus)引起, 经伊 蚊叮咬而传播的一种以发热、皮疹和全身疼痛为主 要症状的急性传染病[1], 广泛流行于全球热带及亚 热带地区[2-3), 是东南亚地区儿童死亡的主要原因之 一[4]。在我国, 登革热主要分布于广东、海南、广西、福建、台湾等南方及东南沿海各省(自治区)[5-7], 浙 江省杭州市于2017年[8]、义乌市于2009年[9]发生由 输人性病例引起的登革热疫情。素有“四省通衢,五路总头”之称的衢州市于2017年发现1例输入性 病例[10], 并于2019年暴发了一起由本地病例引起的 登革热疫情。为了对该起疫情病例及时做出实验 室确诊, 分析毒株的基因变异和种系进化特征, 从 分子水平追踪传染源, 对采集的患者血清标本, 进行 了登革热血清学、病原学和分子生物学特征研究。

1 材料与方法 1.1 病例来源

2019年10月30日晚,衢州市疾病 预防控制中心(CDC)确诊1例本地登革热病例, 调 查人员立刻前往该病例所在村庄开展流行病学调 查, 10月31日至11月3日经现场搜索后又发现7例 确诊病例, 累计报告8例登革热确诊病例,基本确认 是一起登革热暴发疫情。

1.2 病例血清标本采集

经患者知情同意后无菌 采集血液标本5ml, 专车冷链送至衢州市CDC实验 室, 分离血清立即进行检测,多余的血清标本置 于-80 C低温保存。

1.3 抗原检测

应用胶体金方法对血清样本进行 登革病毒NS1抗原检测, 试剂购于澳大利亚Panbio 有限公司, 在有效期内使用,详细的操作说明及结果 判定都严格按照试剂说明书进行。

1.4 病毒核酸检测

病毒核酸的提取严格按照 MagMAX-96病毒核酸抽取试剂盒使用说明书进行,取样200 μl, 最终洗脱至80μl, 作为模板。采用浙 江省CDC微生物检验所下发的引物和探针, 采用实 时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法进行登革病毒核 酸检测, 具体参照登革热诊断标准WS216-2018附 录A[11]

1.5 E基因扩增

参考文献12]设计引物, 试剂采 用宝生物工程(大连)有限公司one Step RNA PCR Kit (Code No: DRR024A), 严格按试剂说明书进行。反应条件:42 ℃ 30 min反转录, 94 ℃ 2 min后, 94 ℃ 30s,51 ℃ 30s,72 ℃ 2min, 循环40次;72 ℃延 伸8min。取扩增产物5μl, 用1.5%琼脂糖凝胶电 泳, 根据Marker位置确认反应产物。

1.6 序列测定与分析

采用PCR扩增产物纯化后 直接测序, 由.上海伯杰生物科技有限公司完成。采 用MAFFT 7.0软件对序列进行比对, 核苷酸和氨基 酸相似性分析采用DNAStar 7.1软件, 进化树的构建 采用MEGA 7.0.14软件最大似然法。

2 结果 2.1 基本情况

指示病例余某, 10月25日晚自觉 畏寒、乏力, 于10月26日,上午到当地卫生室就诊(最 高时体温39.3 ℃), 给予输液治疗2d, 未好转。10 月29日下午到衢州市人民医院呼吸内科就诊, 检测 白细胞计数1.8 × 109/L, 血小板4.9 × 109/L, 10月30 日病毒NSI抗原阳性, 以疑似登革热收治到分院住 院,当晚衢州市CDC检测登革病毒核酸阳性, 血清 型为Ⅰ型。截止到11月3日, 疫情得到有效控制, 本 起疫情实验室共确诊8例。

2.2 实验室结果 2.2.1 抗原、核酸检测

应用胶体金免疫层析法对 8例病例血清标本进行登革病毒NS1抗原检测, 结 果均为阳性;同时对标本血清核酸进行登革病毒型 特异性RT-qPCR法测定, 检测为登革病毒1型。病 例相关信息见表 1

表 1 浙江省衢州市8例病例的相关信息 Table 1 Relevant information of eight patients in Quzhou city, Zhejiang pvovince
2.2.2 E基因进化分析

本次采用衢州市8株登革 病毒1型的E基因核苷酸序列,与来自GenBank中 不同国家和地区的35株不同基因型代表株相应区 段核苷酸序列MEGA 7.0.14软件最大似然法构建系 统进化树, 如图 1显示,8株毒株均聚集在登革病毒. 基因Ⅰ型进化支中, 且与JF960228(2010年新加坡 分离株)亲缘性最近。

注:●代表8株衢州分离株;其他为从GenBank下载的参考毒株。 图 1 2019年浙江省衢州市8株登革病毒与35株登革病毒1型参考株的E区核苷酸序列系统进化分析 Figure 1 Phylogenetic analysis based on the envelope gene sequence of 8 dengue type 1 virus (DENV - -1) strains isolated from Quzhou in 2019 and 35 DENV-1 strains from GenBank
2.2.3 核酸相似性分析

采用DNAStar 7.1软件中 MegAlign对项目中的20条序列进行核苷酸和氨基 酸相似性分析。表 2显示, 衢州地区8株登革病毒核 苷酸和氨基酸同源性均为100%, 说明他们均为同 一株病毒。衢州地区8株病毒与JF960228(新加坡,2010)核苷酸相似性最高,为99.1%, 与KR057906 (中国广州, 2014)核苷酸相似性最低, 为97.4%。衢 州地区8株病毒与KP055776(中国中山, 2014)、KP723474(中国广州, 2014)、KJ438294(中国广“州,2013)、JF967923(泰国, 2010)和EF508203(中国广 州, 2006)氨基酸相似性最高, 均为100%, 与 EF113153(中国广州, 2006)氨基酸相似性最低, 为 99.0%。

表 2 登革病毒1型分离株E基因的核苷酸和氨基酸相似性分析结果 Table 2 Similarity analysis of nucleotide and amino acid sequences of the envelope gene of dengue type 1 virus strains
2.2.4 氨基酸位点分析

对8株登革病毒与12株同 型参考株进行E蛋白氨基酸位点差异分析显示, 仅 在E基因的毒力位点区域发现了1处氨基酸变异,为E基因Ⅰ区中的V6I。Ⅱ和Ⅲ区未发现氨基酸的 变异。

3 讨论

根据本次疫情确诊的8例病例临床表现、流行 病史和实验室诊断, 判定其为-起本地登革热暴发 疫情的可能性较大, 传染来源不详。分析如下:①8例 病例发病前1个月均未离开过衢州市, 基本上在同 一村庄活动, 均属于本地病例;②该村庄户籍人口 1 700人,实际居住人口超过4 000人,村中人员流动 性大, 出租户多, 人员密集, 难以确认具体的传染来 源;③近期雨水偏多, 高温、高湿, 非常有利于白纹伊 蚊(Aedes albopictus)(登革病毒的主要媒介)的生长 繁殖;④截止到11月3日,衢州市2019年已报告约 20例输人性登革热病例, 较2018年上升600%, 病例 主要来自柬埔寨、越南、印度尼西亚等东南亚流行地 区,分布于衢州市下辖的各县(市、区) ;⑤该村庄环 境复杂, 村中多处废弃房屋, 垃圾乱堆, 杂草丛生, 蚊 媒密度高;10月31日监测显示, 布雷图指数仍高达 18, 叮咬指数3只/(人.h), 极有可能是村中流动人 员感染登革病毒而未及时发现, 导致村中出现暴发 疫情。

目前, 最广为接受的登革病毒基因分型使用的 基因区域是E基因区域。根据病毒包膜蛋白E的抗 原性不同, 将登革病毒分为4个血清型(1~4型)。据报道, 2007年在马来西亚沙捞越1名37岁的农民 身体上又发现了5型登革病毒血清型(森林型)[13], 但其中尤以登革病毒1型流行较为广泛[14]。将衢州 市本起暴发疫情与来自GenBank中不同国家和地区 的病毒代表株进行比较并构建系统进化树, 发现 8株毒株均聚集在登革病毒1型的Genotype Ⅰ中,与 JF960228互为姐妹群, 且与JF960228核苷酸及氨基 酸相似性较高;同时, 对E蛋白氨基酸位点差异进行 分析, 发现在E基因的毒力位点区域有1处氨基酸 变异, 为EⅠ区中的V6I, Ⅱ和Ⅲ区未发现氨基酸变 异。本次衢州病毒株为登革病毒1型GⅠ亚型, 与 新加坡2010年分离的病毒株(序列号JF960228)亲 缘关系最近, 其同源性也相对较高, 据此推测病毒株 来源于新加坡等东南亚国家的可能性较大。

衢州市位于浙江省西部, 钱塘江上游, 以山地丘 陵地带为主, 生态良好, 森林覆盖率达71.5%。近年 来衢州市蚊媒监测发现,主要蚊种有淡色库蚊 (Culex pipiens pallens) 、致倦库蚊(Cx. pipiens quinquefasciatus)、骚扰阿蚊(Armigeres subalbatus)、中华按蚊(Anopheles sinensis)、三带喙库蚊(Cx. tritaeniorhynchus)和白纹伊蚊, 这些蚊种的存在, 提 示衢州市存在登革热等蚊媒传染病的传播风险。同 时, 衢州市的气候条件以及人们的生活环境适宜蚊 虫孳生, 大大增加了人类同蚊媒的接触机会, 也增加 了登革热等蚊媒传染病的发病概率。

随着改革开放和招商引资的进一步发展, 国际商 贸、劳务、旅游活动、探亲访友等越来越频繁, 尤其是 与疫情流行国家及地区人员之间的往来,增加了登革 病毒传播的潜在风险;该病病情-般轻微, 但易误诊, 诊治不及时, 易引起扩散, 导致暴发流行。因此要密 切注意境外疫情动态, 加强对来自登革热疫区人员的 观察, 尽早发现病例并立即进于流彳病学应急处置及 采样检测, 做好蚊虫杀灭工作, 防止疫情扩散蔓延。

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