黄胸鼠（Rattus tanezumi）是我国常见的家栖鼠^[1]，不仅是鼠疫、肾综合征出血热（HFRS）、钩端螺旋体病、恙虫病等众多传统病媒性疾病的重要宿主^[2]，还是巴贝西原虫、巴尔通体等新发传染病病原体的宿主，对于鼠传疾病防治具有重要的研究价值^[3-5]。

哺乳动物线粒体DNA为母系遗传，共价闭合的环状双链DNA分子，双链分子中外环为重链（H链），内环为轻链（L链）。基因序列组成相对保守，无重组和单拷贝，并易于检测。由于其结构和进化上的特点，线粒体DNA（mtDNA）被作为研究物种进化的重要分子标记^[6-8]。Cytb基因在线粒体基因组中进化速度适中，一个较短的片段就可以将种下水平以及科水平的系统发育信息包含在内，适合研究种内到种间甚至科间的系统发育关系^[9]。在mtDNA各基因中，因其碱基序列稳定性较高而常用于动物类群的遗传多样性和亲缘关系研究^[10]。

动物线粒体上的Cytb基因被认为是探讨近缘种间和种内遗传分化程度的良好指标^[11]，在物种分类学研究中有较强的适用性，已经在多种动物类群中都得到了有效应用^[12]。易金鑫等^[13]通过研究Cytb基因序列表明北盘江下游尼罗罗非鱼群体具有丰富的遗传多样性。Luo等^[14]通过测定厦门海域和青岛海域的文昌鱼线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ基因和Cytb基因的部分序列表明厦门文昌鱼和青岛文昌鱼为不同种。胡群等^[15]根据线粒体Cytb基因部分序列，对入境集装箱中截获的鼠样本进行了种类鉴定。

本研究以云南省金水河、清水河、磨憨和姐告4个不同口岸为研究对象，对4个不同地理种群的黄胸鼠线粒体DNA Cytb的序列特征和各种群间的遗传分化和进化关系进行了分析，为进一步深入研究不同地区黄胸鼠种群遗传特性积累了基础资料。此外黄胸鼠还与许多传染性疾病流行有关^[2]，因此研究黄胸鼠种群遗传特性对于疾病的预防、治疗和鼠害的防控具有重要意义。

2014－2015年期间4个口岸共捕获黄胸鼠标本55只，金水河、清水河、磨憨和姐告口岸分别为20、10、5和20只。取捕获鼠的肝脏保存于-80 ℃冰箱。

取出-80 ℃冰箱中保存的黄胸鼠肝脏组织，剪取约25 mg，参照天根生化科技（北京）有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（DP304）提取基因组DNA。

正向引物：5'-GACAGGAAAAATCATCGTTG-3'；反向引物：5'-TTCATTACTGGTTTACAAGAC-3'。扩增体系总体积为50 μl：模板DNA 1 μl，正、反向引物各1μl，Premix Taq（TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye）25μl，加纯水将体积补至50 μl。PCR反应的循环参数为：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸8 min。PCR扩增产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳后，Goldview染色，紫外凝胶成像仪扫描检测。

将PCR产物进行正反链双向测序。测序由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成。测序结果与选自GenBank的同源序列使用Clustal X 2.0软件进行多重序列比对^[16]，并辅以人工校对。按照Kimura双参数法（kimura-2-parameter），用MEGA 7.0软件分析每条序列的碱基、氨基酸组成和密码子使用频率，并选用Kimura-2-Parameter模型计算物种间DNA序列间遗传距离差^[17]。选用小家鼠（Mus musculus）为外群。并用MEGA 7.0软件包以距离矩阵邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统进化树^[18]。在NJ树中分枝处的置信度采用1 000次自引导法重复检测。

扩增后产物经琼脂糖凝胶电泳可见清晰、明亮的约1 140 bp的预期目标条带，见图 1。

注：M为DL2 000 Marker，CK为阴性对照。4个口岸共有55个黄胸鼠样本，图中仅列出32个，1~20为金水河口岸样本，21~30为清水河口岸样本，31~32为磨憨口岸样本（部分）。 图 1 云南省4个口岸的黄胸鼠Cytb基因电泳检测（部分） Figure 1 Electrophoresis detection of the cytochrome b gene of Rattus tanezumi at four ports in Yunnan province (partial samples)

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对Cytb基因序列采用双向测序，并且重复测定样品。

4个口岸地区黄胸鼠种群个体的Cytb基因序列用软件Clustal X 2.0和DNAMAN v8.0加以排序比较，可以得到1 125 bp比较完整的序列片段。为了验证Cytb基因片断的正确性，将转换成FASTA格式后的序列在NCBI数据库中（http://www.ncbi.nih.gov./BLAST/）进行BLASTn同源相似性搜索。结果表明，试验所测得的序列均为Cytb基因序列。

测定了金水河、清水、磨憨以及姐告4个口岸地区黄胸鼠的线粒体DNA基因约1 140 bp片段序列，经比对后，每个口岸选取1条Cytb基因序列，片段长度约为1 125 bp，其中金水河和姐告口岸黄胸鼠Cytb基因序列已录入GeneBank数据库。

用MEGA 7. 0软件对获得的Cytb基因进行比对分析，见表 1。所测定的Cytb基因部分序列中，T、C、A、G平均含量分别为28.90%、27.90%、30.87%和12.33%。其中（A+T）含量占59.77%，（C+G）含量占40.23%。密码子第1~3位点碱基组成存在差异，第1位点富含A，平均含量为27.17%，第2位点富含T，平均含量为41.90%，第3位点富含A，平均含量为45.00%；同一碱基在密码子不同位点存在差异，T在第2位点含量最高，为41.90%，C在第3位点含量最高，为34.70%，A在第3位点含量最高，为45.00%，G在第1位的含量最高，为22.75%。

表 1 云南省4个口岸的黄胸鼠Cytb碱基组成百分比 Table 1 Percentages of bases of the cytochrome b gene of Rattus tanezumi at four ports in Yunnan province

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Cytb基因序列碱基组成如表 2所示。Cytb基因的碱基T、C、A、G的平均含量分别为28.90%，27.90%，30.87%和12.33%，清水河口岸的（A + T）含量最低为59.50%，金水河与磨憨口岸的（A + T）含量最高，均为60.00%。总体看来，（A + T）含量高于（C+G）。

表 2 云南省4个口岸黄胸鼠Cytb基因碱基组成百分比 Table 2 Base composition of the cytochrome b gene of Rattus tanezumi at four ports in Yunnan province

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通过MEGA v7.0软件分析，统计4个不同口岸地区的黄胸鼠的密码子使用频率，从而推断Cytb编码区的密码子使用频率和氨基酸组成。从表 3、4可知，密码子UCA、CUA、CCA的使用频率较高，分别是3.19%、3.11%、3.09%。也有一些氨基酸并未出现，包括AUG、GUG、CCG、ACG、GCG等。氨基酸的组成显示，亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸使用频率较高，分别为15.13%、10.44%、8.17%。

表 3 云南省4个口岸黄胸鼠Cytb基因片段密码子的使用频率 Table 3 Codon usage frequencies of the cytochrome b gene fragment of Rattus tanezumi at four ports in Yunnan province

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表 4 云南省4个口岸黄胸鼠Cytb基因片段氨基酸组成 Table 4 Amino acid composition of the cytochrome b gene fragment of Rattus tanezumi at four ports in Yunnan province

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遗传距离最近的是姐告和清水河口岸黄胸鼠，为0.000；遗传距离最远的分别是金水河与清水河，金水河与姐告口岸黄胸鼠，均为0.008。将4个口岸黄胸鼠的Cytb基因序列与美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站的小家鼠和褐家鼠（R. norvegicus）进行比对，结果见表 5。

表 5 云南省4个口岸黄胸鼠遗传距离 Table 5 Genetic distance of Rattus tanezumi at four ports in Yunnan province

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以同属于啮齿目的小家鼠（NC_005089.1）和褐家鼠（NC_001665.2）为外群，采用NJ法、“Bootstrap”1 000循环检验构建分子系统进化树（图 2）。根据进化树可知：总体来看分为3个大聚类簇，R. tanezumi Jinshuihe独立1个分支，R. tanezumi Mohan与R. tanezumi Viet Nem、R. tanezumi Japan聚在一起，R. tanezumi Qingshuihe与R. tanezumi Jiegao、R. tanezumi Thailand聚在一起，两个分支构成第1个聚类簇。对外群分析发现，两个外群各自聚为1支，与4个口岸地区黄胸鼠分开，各自构成1个聚类簇，且外群亲缘关系基本符合其阶元划分，从而可知外群选择的正确性。

图 2 利用邻接法构建云南省4个口岸黄胸鼠Cytb基因序列的进化树 Figure 2 Phylogenetic tree of cytochrome b gene sequences of Rattus tanezumi from four ports in Yunnan province based on the neighbor-joining method

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Cytb基因在线粒体基因组中的进化速度适中^[19]，较短的1个DNA片段就能包含从种水平到属水平乃至纲水平的系统发育信息。而且在一定的进化尺度内，Cytb基因不受饱和效应的严重影响，所提供的系统发育信息和遗传分化水平更适于分析种间和属间差异^[20]，因此本研究通过测定黄胸鼠Cytb基因序列来研究4个不同口岸地区黄胸鼠的种群特性。测定的4个不同口岸黄胸鼠mtDNA Cytb基因部分序列的碱基组成中，T、C、A 3种碱基的含量差异较小，G含量最低。其中（A+T）含量明显高于（C+G）含量，推测黄胸鼠mtDNA可能存在（A+T）偏倚性。4个不同口岸地区黄胸鼠间的4种碱基组成相似，具有相同的变化规律。Cytb基因序列中A含量最高，其次是T，然后是C，最后是G含量最低，这与啮齿类动物mtDNA基因组中碱基含量A＞T＞C＞G的研究结果一致^[21]。

4个不同口岸黄胸鼠mtDNA Cytb基因部分序列中，不同位点碱基含量不同，均为密码子的第1位点和第3位点富含碱基A，第2位点富含碱基T。其中C在第3位点最高，G在第2位点含量最高。（A+T）含量在第3位点最高，而（C+G）含量在第3位点最低，可见在不同位点黄胸鼠间密码子的碱基组成存在较大偏倚。比较其密码子的使用频率，同一密码子在黄胸鼠间的使用频率不平衡，表明密码子的使用频率存在偏倚性。对4个不同口岸地区的黄胸鼠密码子使用频率进行分析发现，CUA、AUU、UUC等密码子使用频率较高，而GUG、ACG、GCG等密码子未出现。通过分析Cytb基因片段氨基酸组成发现亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等氨基酸使用频率较高。

黄胸鼠分布与城市化进程中环境的变迁，交通工具的发达，气候的改变，以及人为因素的影响有关^[22-24]。遗传距离分析发现，姐告与清水河口岸黄胸鼠Cytb基因差异程度很小，两个口岸同属于南亚热带季风性湿润气候，且两个口岸交通运输发达、人口密集，可能与黄胸鼠种群特性有关。Brouat等^[25]在塞内加尔东南部的多乳鼠研究结果发现种群存在明显的距离隔离，表明地理障碍对于种群基因流的阻碍作用。当在局限空间内分散的物种达到突变-迁移-漂变平衡时，遗传分化是随着地理距离的增加而增加的^[26]。本研究中金水河与清水河、姐告口岸的Cytb基因差异程度较大，可能与地理距离有关。

根据Musser和Carleton^[27]的研究，黄胸鼠是印度次大陆北部，华南和中部以及印度支那大陆（云南省为中部地区）的本地物种。云南省位于中国西南和东南亚的边界地区，由于复杂的地质和气候历史，物种的种内遗传多样性较高^[28-29]。临沧高速公路在建，清水河口岸地区交通便利，有利于黄胸鼠迁移扩散。NJ进化树分析可知，清水河口岸黄胸鼠与瑞丽姐告口岸黄胸鼠亲缘关系较近，且与泰国地区黄胸鼠亲缘关系也较近，口岸地区贸易往来密切，黄胸鼠可能通过商品贸易货车等交通工具运输发生迁移。磨憨口岸黄胸鼠与日本、越南地区黄胸鼠亲缘关系较近，可能是通过汽车或国际航行船舶等交通工具进行扩散。黄胸鼠在云南地区的传播受到地理障碍的限制，不适合IBD（Isolation by distance）模式，但可以利用人类运输实现远距离扩散^[30]，金水河口岸黄胸鼠与其他3个口岸黄胸鼠的亲缘关系相对较远，可能与红河金水河口岸地理位置有关。黄胸鼠作为1个家栖鼠种，其活动和繁殖都会受到人为因素的影响，地理距离较远的黄胸鼠随着火车和汽车等交通工具迀移而发生基因交流，后续可以通过分析黄胸鼠种群的遗传分化系数F_ST与地理距离的关系来确定这种基因流与地理距离的相关性。