登革热是由登革病毒(DENV)引起的一种虫媒传染病, 主要分布在热带、亚热带地区, 最主要的传播媒介是埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Ae. albopictus)^[1]。登革病毒根据抗原不同分为4种血清型(DENV1~4), 每种血清型均可引起登革热症状^[2]。世界范围内, 每年大约有3.9亿例登革热感染者, 其中9 600万例出现临床症状, 造成极为严重的疾病负担^[3]。登革病毒不但可以在"蚊-人-蚊"中循环传播, 还可以在蚊虫体内通过垂直传播的方式传递给后代^[4]。除了南方少数省份外, 我国大部分地区为白纹伊蚊分布区, 该蚊为此类地区登革热的传播媒介^[5]。对白纹伊蚊进行登革病毒检测, 具有重要意义。

1 白纹伊蚊登革病毒感染机制

登革病毒必须克服白纹伊蚊中肠感染屏障、中肠逃脱屏障、涎腺屏障, 最终进入涎腺内腔, 才能进一步传播病毒^[6]。蚊虫通过吸食带病毒血液获得登革病毒, 病毒附着、侵入并在中肠上皮细胞内复制, 在中肠上皮细胞内建立感染, 经过中肠逃脱屏障, 产生感染性病毒颗粒, 经蚊基底细胞层, 经血淋巴扩散, 最后感染涎腺, 进入涎腺腔, 随着叮咬吸血活动感染其他宿主^[7]。登革病毒可通过改变白纹伊蚊中肠基因的表达等方式, 使其更利于病毒的感染^[8]。蚊虫感染登革病毒后第7天, 98.2%的蚊虫中肠感染病毒, 感染后的第12~14天, 前肠与后肠的感染率也分别升高至97.0%和94.4%, 感染后第7天, 有60.7%的涎腺近端感染病毒, 而感染后第12~14天, 涎腺近端感染率升高至95.8%^[9]。蚊虫不同组织感染率的变化, 在一定程度上显示了病毒在蚊虫体内传播的顺序。

垂直传播也是白纹伊蚊登革病毒感染的重要途径, 白纹伊蚊滞育卵内检测到登革病毒, 且在解除滞育后的子代幼蚊和成蚊中检测到登革病毒, 证明该病毒能够在白纹伊蚊滞育卵内存活并传递^[1]。另外, 感染的雄蚊通过交配, 可将登革病毒传给雌蚊^[10]。

2 蚊虫登革病毒常见检测方法 2.1 病毒分离培养

病毒分离培养是蚊虫登革病毒诊断的金标准, 主要包括动物接种法和组织培养法^[11]。动物接种法对实验室级别要求高、费用昂贵, 应用较少。组织培养法是将病毒标本处理后接种于敏感细胞, 培养后电镜下观察细胞病变效应, 并进一步分离病毒。白纹伊蚊C6/36细胞对登革病毒的4种血清型都敏感, 操作简便, 且病毒分离的阳性率达95.0%, 可作为病毒细胞培养的首选方法^[12]。除此之外, 伪盾伊蚊(Ae. pseudoscutellaris)AP-61细胞、CLA-1细胞、LLC-MK2细胞、Vero细胞、BHK-21细胞等也可用于登革病毒的分离培养^[12]。病毒分离法操作繁琐, 标本中病毒含量少或病毒活性低时, 产生细胞病变慢, 实验周期较长, 因此一般不用于早期诊断。

2.2 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术

PCR技术是利用双链DNA分子碱基配对原则, 在一定条件下扩增DNA片段的体外扩增方法。反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription and polymerase chain reaction, RT-PCR)是登革病毒检测的常用方法, 其特点是敏感、快速、所用标本量少, 可直接检测病原体, 不需要等待抗体的产生, 常用于早期诊断^{[11, 13]}。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)自动化程度高, 比常规PCR仪特异性更强, 且有效解决了常规PCR的污染问题^[11]。TaqMan探针实时荧光PCR技术为一种灵敏、特异、快速、低污染的登革病毒检测方法, 可定性或定量检测登革热病例早期血清中的登革病毒^[14]。多重实时荧光定量RT-PCR方法可同时检测登革病毒、基孔肯雅病毒等多种病毒, 灵敏度高、特异性强、稳定性好, 是一种可同时快速检测多种蚊媒病毒的新方法^[12]。巢式PCR(nested PCR), 扩增特异性较强, 但较易污染^[11]。

除此之外, 血清学方法如中和试验、补体结合试验、凝胶免疫电泳、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验等^[14]也可用于蚊媒体内登革病毒的检测, 主要用于检测蚊虫体内的病毒抗原, 可能存在一定的交叉反应。杂交技术与基因芯片技术等也可用来测定蚊体内登革病毒^[11]。

3 白纹伊蚊对登革病毒易感性影响因素

白纹伊蚊对登革病毒的易感性主要与蚊虫的遗传背景差异、病毒滴度、血清型、毒力、温度、湿度、营养和个体大小等因素有关^[15]。

3.1 病毒滴度

白纹伊蚊中肠是登革病毒通过消化道入侵的主要屏障, 因此, 中肠上皮细胞的抗感染能力决定了蚊虫对登革病毒的敏感性。而中肠屏障是一个相对的概念, 其存在一定的感染阈值, 当病毒滴度升高时, 白纹伊蚊个体变得易感, 屏障消失, 白纹伊蚊的感染率和经口接种的病毒滴度呈正相关验证了这一观点^[15]。剂量反应关系表明, 随着患者血液中病毒滴度的升高, 蚊虫的感染率不断上升, 直至饱和^[16]。

3.2 病毒血清型

不同区域的蚊虫种群对同一型登革病毒株的易感性不同^[17], 同一区域的蚊虫对不同型别的登革病毒株的易感性也不相同^[18]。Mulyatno等^[19]研究发现, 2008-2015年印度尼西亚泗水市蚊虫中登革病毒优势种群从DENV-2型转变为DENV-1型, 随后又转变为DENV-2型, 再转变为DENV-1型, 蚊体内登革病毒血清型随着人群中优势血清型的变化而变化。Nguyet等^[16]研究发现, 能使50.0%的埃及伊蚊感染的患者血清滴度, DENV-1和DENV-2型比DENV-3和DENV-4型要低10倍。张海林等^[20]研究发现, 云南省白纹伊蚊感染登革病毒后第10天叮咬乳鼠, DENV-1型的传播率为22.0%, DENV-2型传播率为37.5%, DENV-3型传播率为25.0%, DENV-4型传播率为44.4%。而垂直传递效能, 白纹伊蚊对DENV-1比DENV-2型更敏感^[21]。Thongrungkiat等^[22]发现, 登革热的4种血清型都能在实验室条件下, 通过垂直传播给后代, 并且其传播效能是DEN-4>DEN-3>DEN-1>DEN-2。

3.3 气象因素

温度和湿度对白纹伊蚊生存能力及登革病毒传播效能都有一定的影响, 在一定范围内, 随着温度的升高, 病毒在蚊体内的繁殖速度增快, 而湿度可能对温度有一定的协同作用^[15]。18℃可能是白纹伊蚊传播登革病毒的最低温度, 随着温度的升高蚊虫感染率和传播率逐渐升高, 至一定阈值后, 再逐渐降低^[23]。Tsai等^[24]研究发现, 白纹伊蚊经口感染DENV-1后, 在16℃或28℃时白纹伊蚊的存活率最高, 而在22℃和28℃时蚊体内病毒滴度最高。气象因素对伊蚊的垂直传递效能也有一定的影响, 与赤道气候比较, 伊蚊在干旱气候下有更高的垂直传递效能, 而暖温带气候下伊蚊的垂直传递效能较低, 在低温条件下垂直传递对于登革病毒的传播有更重要的作用^[12]。Thongrungkiat等^[22]研究发现, 不同季节登革病毒在蚊体内垂直传递效率不同, 最小感染率分布为0~24.4/1 000只蚊虫。

3.4 感染者症状的影响

一般认为, 在症状出现前1.5 d, 至症状出现后5.0 d, 登革热患者对蚊虫具有传染性^[15]。Nguyet等^[16]将未感染蚊虫与208例登革热患者接触, 发现仅有少量蚊虫在患者症状出现的第6天感染登革病毒, 而没有蚊虫在患者出现症状的第7天获得感染, 并且早期病毒血症较高的病例可能具有更长的感染期。无症状感染者在病毒传播方面也起一定的作用, 这也是登革病毒在自然界的保存机制^[25]。

3.5 蚊体内共生菌的影响

媒介伊蚊体内共生菌如沃尔巴克氏体(Wolbachia)可影响登革病毒的传递。虽然感染沃尔巴克氏体不能降低白纹伊蚊对登革病毒的敏感性, 但可导致胞质不相容性现象, 即交配产生的子代不能正常发育而发生早期的胚胎死亡, 使登革病毒不能有效地垂直传递下去^[26-27]。除此之外, 伊维菌素处理的白纹伊蚊, 对DENV-2型的感染率可降低49.6%^[28]。

4 可能影响白纹伊蚊病毒检测的因素 4.1 成蚊标本采集的影响

白纹伊蚊成蚊监测与采集目前还没有特别有效的方法, 常用的方法有CO₂诱蚊灯法、双层叠帐法、人诱停落法、诱蚊诱卵器法等^{[2, 29]}。人诱停落法捕捉的蚊虫数量比双层叠帐法和人帐诱法多, 但人诱停落法不适合在登革热疫区使用^[30]。考虑到安全性及敏感性等问题, 登革热监测及标本采集过程中, 成蚊采集常用CO₂诱蚊灯法和双层叠帐法, CO₂诱蚊灯法捕获的成蚊数量要多于双层叠帐法^[31], 而这2种方法诱集的蚊虫大多为未吸血蚊虫, 利用未吸血蚊虫进行病毒检测, 可能会低估病毒感染率^[2]。诱蚊诱卵器法采集的蚊虫大部分为吸血后产卵的蚊虫, 因此, 用作病毒检测可能效果更好, 但诱蚊诱卵器法很难采集到足够数量的成蚊标本^{[2, 32]}。

4.2 幼蚊标本采集的影响

蚊体内的登革病毒可垂直传递给子代, 垂直传递可能为非流行时期登革病毒的保存机制^[33]。因此, 白纹伊蚊幼蚊也是登革病毒检测的重要标本。白纹伊蚊幼蚊采集方法主要为直接收集积水容器中的幼蚊或诱蚊诱卵器法^[34]。登革病毒在干燥的卵内能存活且能通过白纹伊蚊垂直传播病毒, 不同子代, 病毒感染率不同。张海林等^[35]对感染登革病毒的雌蚊子代进行病毒检测, 子1代的阳性率, DENV-1型为10.0%, DENV-2型为22.2%, DENV-3型为33.3%, DENV-4型为29.0%, 子2代检测DENV-4型的阳性率为35.3%。郭晓霞等^[36]研究发现, 白纹伊蚊干燥卵能保存登革病毒, 第1生殖营养周期F1代蚊虫未能检测到病毒, 而第2和第3生殖营养周期蚊虫检测出阳性, 阳性率分别为26.7%和27.8%。感染登革病毒的雌蚊在第2及以后生殖营养周期产的子代较第1生殖营养周期产的子代病毒感染率高, 可能与病毒在伊蚊体内的传播速度有关。研究表明, DENV-2型经口感染白纹伊蚊后第9天才能在卵母细胞、输卵管和滤泡上皮细胞中检测到病毒^{[9, 37]}。而伊蚊在饱血后即卵子发生开始, 可能在病毒未到达卵巢前就已完成第1生殖营养周期, 故通常在此间产的子代中可能检测不到病毒^[38]。

4.3 采集地点及保存方式的影响

由于白纹伊蚊的飞行距离有限, 因此, 在登革热疫点地区采集的蚊标本可能具有更高的检出率。另外, 登革病毒是RNA病毒, 因此蚊标本在采集、运输和保存过程中, 是否接触乙醚、乙醇等有机溶剂, 是否低温冷冻, 也影响登革病毒的检出率^[39]。白纹伊蚊的病毒携带率低, 且病毒很容易失活, 检测时经常观察到0感染现象, 大的样本量是获得蚊类检测阳性结果的重要条件。