斑疹伤寒群立克次体(Typhus group rickettsias, TGR)是引起人类斑疹伤寒(Typhus fever)的病原体, 主要包括普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)和莫氏立克次体(R. mooseri)。普氏立克次体引起流行性斑疹伤寒(Epidemic typhus), 其以人的体虱为传播媒介, 在人与人之间传播, 往往引起大流行, 又称为虱传斑疹伤寒；莫氏立克次体引起地方性斑疹伤寒(Endemic typhus), 其以鼠类为宿主, 蚤为传播媒介, 又称蚤传斑疹伤寒或鼠型斑疹伤寒^[1-2]。流行性斑疹伤寒须在多虱状态下, 由虱在人群间转移而传播疾病。近年来由于生活水平的改善, 流行性斑疹伤寒已罕见报道。地方性斑疹伤寒是一种自然疫源性疾病, 该病的流行与当地的鼠密度以及温度、湿度及蚤的孳生密切相关, 易形成地方性暴发流行。鼠类是地方性斑疹伤寒重要的储存宿主^[3]。了解斑疹伤寒在宿主中的保存状况和基因特征, 有利于进一步了解和控制斑疹伤寒的流行。云南省斑疹伤寒年平均发病率在2.34/10万左右, 年发病数从672例到1 369例不等^[4], 全省各地州均有病例, 且时有暴发流行^[5-8]。为调查地方性斑疹伤寒在鼠类等宿主中的感染状况, 了解该病的潜在流行风险, 我们于2015年8月至2017年9月随机在泸西县捕获小型哺乳动物并采用间接免疫荧光试验(IFA)和巢式PCR法分别检测动物的血清抗体和特异性基因, 以调查泸西县小型哺乳动物携带斑疹伤寒的状况。

2015年8月至2017年9月在云南省泸西县居民区和野外山坡地采用鼠笼和鼠夹法捕获小型哺乳动物, 选好生境点或居民点后, 于下午或傍晚布笼布夹, 次晨收回。捕获动物经现场分类鉴定和登记后, 解剖取动物肺、肝、脾、肾等脏器, 液氮冻存待检。其中活体在解剖前取血, 分离血清。

采用IFA检测动物血清中斑疹伤寒莫氏立克次体抗体。用pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释待检鼠血清、阳性对照和阴性对照血清至1:50, 加到抗原片上的反应孔中, 37 ℃放置40 min。用PBS洗涤3次, 每次1 min, 冷风吹干。用约1:5 000的伊文思蓝稀释羊抗鼠IgG荧光抗体至使用浓度, 加入抗原片, 37 ℃放置30 min, 用PBS洗涤3次, 吹干。在荧光显微镜下观察结果。在阳性和阴性对照均成立的情况下, 根据特异性荧光的强弱来判定结果, 以“+”为阳性^[9]。莫氏立克次体抗原片购自美国Fuller公司。

从冰箱或液氮中取出标本, 室温放置一段时间后, 用剪刀剪3~5 mm见方(约50 mg)的脾组织, 放入乳钵内研磨, 待磨碎后加入适量的无菌蒸馏水制成适当浓度的混悬液, 吸到一个1.5 ml的离心管内。取组织悬液50 μl, 按照百泰克DNA提取试剂盒说明书的操作方法提取样本核酸, 得到的样本DNA溶液存放在-20 ℃待用。

采用巢氏PCR方法检测斑疹伤寒的热休克蛋白基因groEL。合成立克次体属热休克蛋白基因groEL外引物1对(Gro-1和Gro-2)和斑疹伤寒内引物1对(SF1和SR2)^[10-12]。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成, 见表 1。

表 1 斑疹伤寒检测用引物 Table 1 Primers for detection of typhus

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第1轮PCR采用立克次体通用外引物Gro-1、Gro-2, PCR反应体系为25 μl:2×PCR Master Mix12.5 μl, 正、反向引物各1.0 μl, DNA模板3 μl。PCR反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s, 45 ℃退火40 s, 72 ℃延伸40 s, 共39个循环。最后72 ℃4 min, 产物为616 bp。第2轮PCR为斑疹伤寒内引物SF1、SR2, 反应体系也为25 μl体系, 模版2 μl, 反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性35 s, 56 ℃退火35 s, 72 ℃延伸35 s, 共39个循环。最后72 ℃4 min, 产生217 bp大小的条带。每次实验均设立空白对照、阴性对照和阳性对照, 任何阴性对照都未观察到阳性反应, 阳性对照均有显著特异性条带出现, 表示实验结果成立。取PCR产物5 μl, 用含Goldview染料的1.0%琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像仪观察结果。DNA提取试剂盒为北京百泰克Bioteke提取试剂盒, PCRMast Mix缓冲液等为美国Promega产品；DNA Marker为DL2000, PCR仪采用GeneAmp PCRSystem 9700型, 核酸电泳仪为DYCP-31DN, 电源为北京六一DYY-6D型电源。

将扩增的阳性PCR产物送至生工生物工程(上海)有限公司测序。通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站, 利用“BLAST Sequence Similarity Searching”工具, 测得的序列与GenBank中注册的核苷酸序列进行同源性比较；使用MEGA 6.06软件邻接法(Neighbour-Joining, NJ)构建系统进化树, 进行遗传进化分析。

2015年8月至2017年9月在泸西县野外共放置1 560个鼠笼和鼠夹, 捕获129只小型哺乳动物, 野外捕获率为8.27%(129/1 560)。居民区共放置1 400个鼠笼和鼠夹, 捕获64只, 捕获率为4.57%(64/1 400), 野外捕获率高于居民区。捕获的193只小型哺乳动物共9种, 其中居民区以黄胸鼠(Rattus tanezumi, 37.82%)为优势种, 野外以大绒鼠(Eothenomys miletus, 37.30%)和中华姬鼠(Apodemus draca, 12.95%)为优势种, 优势种群中雌性均多于雄性(表 2)；带菌个体为大绒鼠, 带菌率为1.04%。

表 2 2015－2017年云南省泸西县小型哺乳动物种群构成 Table 2 The composition of small mammals in Luxi county, Yunnan province, 2015-2017

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采用IFA检测鼠血清中斑疹伤寒莫氏立克次体抗体, 从83份鼠血清中检出阳性4份, 阳性率为4.82%(表 3)。其中野外和居民区捕获的黄胸鼠阳性各1份；野外捕获的大绒鼠阳性2份。

表 3 间接免疫荧光试验检测云南省泸西县捕获鼠血清莫氏立克次体抗体结果 Table 3 Immunofluorescence assay detection of Rickettsia mooseri antibodies in the sera of rodents captured in Luxi county, Yunnan province

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对193只个体脾脏标本进行PCR检测, 其中居民区捕获鼠PCR检测结果均为阴性, 从野外捕获的大绒鼠标本中扩增出2份217 bp的特异DNA片段, 部分阳性结果见图 1。

注:M. DL2000 Marker；1~20.样本1~20号；-.空白对照；N.阴性对照；P.阳性对照。 图 1 斑疹伤寒groEL基因部分PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果 Figure 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of the groEL gene of Rickettsia typhi

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阳性标本经PCR扩增后, 对特异DNA片段进行序列测定。将测定的DNA序列输入BLAST分析程序, 在GenBank中搜索, 进行同源性比较。结果显示, 该2株序列相似性为100%, 并与斑疹伤寒莫氏立克次体株(GenBank号:AF075440)的相似性为100%和98%。系统发生树分析显示, LX2和LX89在同一分支, 它们与斑疹伤寒莫氏立克次体AF075440株、AY191590株和AY191591株共处于同一分支, 同源性很高, 遗传关系非常近, 见图 2。

图 2 基于groEL基因部分序列构建的系统进化树 Figure 2 The phylogenetic tree based on partial sequence of the groEL gene

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斑疹伤寒立克次体病曾给人类带来深重的灾难, 第一次和第二次世界大战期间, 数以百万计的人死于流行性和地方性斑疹伤寒等立克次体病^[13-14]。斑疹伤寒的流行主要与贫困和战争等恶劣的环境条件有关, 发达国家由于生活水平高, 卫生条件好, 疾病因此得到有效控制, 但是在发展中国家却时有流行^[15-20]。斑疹伤寒是我国法定报告的丙类传染病之一。新中国成立后, 我国共发生3次上万例感染流行。最后一次发生在1980－1984年间, 多为地方性斑疹伤寒。我国流行性斑疹伤寒已得到有效控制, 但是地方性斑疹伤寒散发仍然较多^[21-22]。普氏立克次体与莫氏立克次体在生物学上高度同源, 在16S rRNA基因的1 500个碱基中普氏与莫氏立克次体仅有7个碱基不同, 而且抗原关系极为密切, 血清学反应交叉严重, 实验室检测难以将它们进行区分。所以2种斑疹伤寒的诊断和鉴别在很大程度上还依赖于对病史和流行病学资料的研究与分析。以体虱传播的流行性斑疹伤寒发病人群主要为流浪者、监狱集中营及民工等卫生条件较差人群。同发达国家一样流行性斑疹伤寒在中国基本得到控制, 而鼠蚤传播的地方性斑疹伤寒主要存在农村等鼠密度较高地区。

云南省地理景观及气候类型多样, 动植物资源异常丰富, 适合小型哺乳动物及蚤、螨类孳生。调查发现云南省当地野鼠和家畜的莫氏立克次体感染率较高, 人群中也有感染。斑疹伤寒每年均有散发病例报道^[23-28], 且境内大理白族自治州、保山市和西双版纳傣族自治州(西双版纳州)分别于2004年6月、2009年8月和2010年9月暴发疫情^[5-8]。为了解地方性斑疹伤寒在云南省各地的潜在流行风险, 本调查选择了鼠密度较高但未发生过斑疹伤寒流行的泸西县采集标本, 共检测到2份热休克蛋白groEL阳性基因和4份莫氏立克次体抗体阳性血清。阳性基因均从大绒鼠体内检测到, 阳性血清分别从大绒鼠和黄胸鼠体内检测到, 2种实验结果表明, 在该地区, 大绒鼠是斑疹伤寒的重要宿主, 其他鼠种也可能携带该病原体, 这与当地的优势鼠种群有关(即优势鼠种群数量多, 捕获数也多, 带菌率也高。)。阳性基因经分析后发现与莫氏立克次体AF075440株和Wilmington株等在同一分支, 与云南省保山市报道相同。与2009年8月保山市和2010年9月西双版纳州暴发流行地区相比, 该地鼠类感染斑疹伤寒阳性率较低, 发生流行的风险不高, 但是该地区存在以大绒鼠为主要宿主的斑疹伤寒自然疫源地, 且本次调查发现, 黄胸鼠在居民区和野外均属于优势鼠种, 证明其频繁活动于野外和居民区两地, 且黄胸鼠也存在斑疹伤寒病原体感染, 黄胸鼠既是储存宿主也具有传播媒介的作用, 由此提示, 疾病控制部门需加强宣传, 提高居民对该类疾病的认知, 做好地方性斑疹伤寒的预防控制工作, 如家居环境灭鼠、防止鼠蚤叮咬等工作。