2020, Vol. 31扩展功能
文章信息
- 胡挺松, 李应, 胡秋凌, 吴学林, 高丽芬, 李国伟, 王志勇, 胡海梅, 王意银, 张海林, 张富强
- HU Ting-song, LI Ying, HU Qiu-ling, WU Xue-lin, GAO Li-fen, LI Guo-wei, WANG Zhi-yong, HU Hai-mei, WANG Yi-yin, ZHANG Hai-lin, ZHANG Fu-qiang
- 云南省楚雄州恙虫病流行特征及其病原体东方体基因分型研究
- Epidemiological characteristics of scrub typhus and genotyping of the pathogen Orientia tsutsugamushi in Chuxiong prefecture, Yunnan province, China
- 中国媒介生物学及控制杂志, 2020, 31(3): 282-288
- Chin J Vector Biol & Control, 2020, 31(3): 282-288
- 10.11853/j.issn.1003.8280.2020.03.008
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文章历史
- 收稿日期: 2019-12-20
2 楚雄彝族自治州人民医院, 云南 楚雄 675000;
3 楚雄彝族自治州疾病预防控制中心, 云南 楚雄 675000
2 People's Hospital of Chuxiong Yi Autonomous Prefecture;
3 Chuxiong Yi Autonomous Prefecture Center for Disease Control and Prevention
恙虫病(scrub typhus)是由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi, Ot)引起的经恙螨幼虫叮咬而传播的自然疫源性虫媒传染病。多种鼠类可作为储存宿主, 寄生在鼠体表的多种恙螨可传播本病[1]。该病全年均可流行, 但主要流行于夏秋季, 人群普遍易感。临床上, 以发热、虫咬焦痂或溃疡、淋巴结肿大和皮疹为特征, 严重者可导致多脏器损伤甚至死亡[1]。恙虫病在全球范围内均有分布, 但东南亚地区是主要流行区[2], 在第二次世界大战期间, 东南亚地区的日军和盟军的恙虫病病例分别为2.0万和1.6万例[3], 成为热带丛林地区对军队危害最大的传染病。恙虫病在我国广泛分布, 云南省为我国恙虫病发病率最高的省份[4], 也是云南省分布最广的一种立克次体病[5-9]。楚雄彝族自治州(楚雄州, 辖10个县、市)位于云南省中部地区, 自2006年开展恙虫病疫情报告以来, 每年均有恙虫病病例发生[10], 并且近几年报告发病数明显上升。本研究对该州2015－2018年恙虫病流行特征进行分析, 并采集本病患者血液标本进行Ot核酸检测和基因型鉴定, 为防治工作提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 病例来源恙虫病病例资料来源于楚雄州传染病报告信息管理系统以及恙虫病流行病学调查资料。采用描述流行病学方法对恙虫病疫情进行统计和流行特征分析。
1.2 标本采集2016年秋季在楚雄州人民医院感染性疾病科采集临床诊断为恙虫病的住院患者血液标本, 患者及家属均知情同意。采集全血标本3 ml, 低速离心, 将血清和血块分别放在2 ml螺旋盖冻存管中, 编号, 置于-70 ℃冰箱保存。
1.3 聚合酶链式反应(PCR)采用半套式PCR检测Ot Tsa56基因(56 kDa type-specific antigen gene), 引物为Ori-TSA56-F:5'-AATGAAAAAAATTATGTT AATTGC-3', Rick-DF-R1:5'-CCAGCATAATTCTTC AACCAAG-3', Rick-DF-R2:5'-TAGGCATTATAG TAGGCTGAGG-3'。使用AxyPrep体液基因组DNA/RNA小量试剂盒提取全血标本液中的DNA。PCR反应使用的酶为GoTag PCR Master mix (Promega), 反应条件:94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共40个循环。72 ℃延伸7min。
1.4 序列测定对Ot核酸阳性样本进行Tsa56基因序列扩增, 引物合成及PCR扩增产物测序均由昆明硕挚生物科技有限公司完成。
1.5 序列分析采用ClastalX1.83软件进行核苷酸序列比对, 用MEGA 6.0软件以邻接法(Neighbor- Joining, NJ)构建Ot的Tsa56基因核苷酸序列系统发生树。本研究除使用本次测定的4株Ot序列外, 并用GenBank中来自中国、日本、韩国、泰国、老挝和缅甸不同基因型的16株Ot相应序列进行同源性和系统进化分析。包括5株Kato、2株Karp、2株Kawasaki、2株Divergent和5株Gilliam(表 1)。
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2006－2018年楚雄州共报告恙虫病3 735例, 每年均有恙虫病疫情发生, 且报道发病数和发病率呈逐年上升之势, 2018年达高峰(图 1)。其中, 2006－2013年发病数占上述13年发病总数的18.96%(708/3 735), 每年发病数在16~150例之间；2014－2018年发病数占81.04%(3 027/3 735)；2015－2018年发病数在265~992例之间, 年平均发病率为22.79/10万(表 2), 2018年发病数占这13年发病总数的26.56%(992/3 735), 发病率为36.15/10万。各县发病率存在明显差异, 位于前5位的永仁县、楚雄市、大姚县、双柏县和南华县发病率依次为74.21/10万、43.36/10万、40.61/10万、38.22/10万和33.58/10万, 其他5个县发病率均较低(0.74/10万~3.24/10万)(表 2)。
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| 图 1 2006－2018年云南省楚雄州恙虫病病例逐年分布 Figure 1 Yearly distribution of scrub typhus cases in Chuxiong prefecture, Yunnan province, China, 2006-2018 |
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2015－2018年楚雄州共报告恙虫病2 507例, 所辖10个县(市)均有病例报告, 其中楚雄市发病数最多(1 044例), 占全州发病总数的41.64%；其次为大姚县(453例)、永仁县(331例)、南华县(328例)和双柏县(251例), 这5个县(市)发病数占全州发病总数的96.01%(2 407/2 507)；其他5个县(武定、禄丰、牟定、元谋和姚安县)发病数仅占3.99%(100/2 507)(表 2)。
2.2.2 季节分布根据2015－2018年2 507例恙虫病统计, 1－12月每月均有病例发生, 主要流行季节为7－10月, 占全年发病总数的88.35%(2 215/ 2 507), 其中7月为353例(14.08%)、8月为777例(30.99%)、9月为659例(26.29%)、10月为426例(16.99%), 8月为高峰(图 2)；其他月份(1－6和11－12月)发病数仅占11.65%(292/2 507), 具有明显的夏秋季流行特点。
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| 图 2 2015－2018年云南省楚雄州恙虫病逐月分布 Figure 2 Monthly distribution of scrub typhus cases in Chuxiong prefecture, Yunnan province, China, 2015-2018 |
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根据2015－2018年2 507例病例进行统计, 各年龄组均有病例发生(图 3), 其中, 0~19岁发病319例, 占发病总数的12.73%(其中0~4岁婴幼儿组发病111例, 占4.43%)；20~59岁组1 670例, 占66.61%；≥60岁518例, 占20.66%；30~69岁年龄组占78.42%。总体来看, 年龄组间发病数存在一定差异, 如中老年组病例多, 但≤29岁年龄组和≥70岁年龄组发病少, 婴幼儿病例稍多于其他5岁以上少年儿童。男性发病1 072例, 女性1 435例, 男女性别比为1:1.34。各职业人群均有发病, 以农民为主(2 129/2 507, 84.92%), 其次为学生(152/2 507, 6.06%)和散居儿童(135/2 507, 5.38%), 其他职业人群发病数较少。
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| 图 3 2015－2018年云南省楚雄州恙虫病病例性别和年龄分布 Figure 3 Sex and age distributions of scrub typhus cases in Chuxiong prefecture, Yunnan province, China, 2015-2018 |
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在楚雄州人民医院采集到6例恙虫病患者血液标本, 经PCR检测, Ot核酸阳性4份, 其中楚雄市2份, 南华和双柏县各1份, 患者背景信息见表 3。对这4例Ot核酸阳性标本进行测序, 获得了4条Tsa56基因序列, 编号为CX1601、CX1602、CX1603和CX1604。另外2例Ot核酸阴性患者(CX1605和CX1606)与阳性患者具有恙虫病典型的临床表现, 为临床诊断病例。
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本次检测到的CX1601、CX1602、CX1603和CX1604的Tsa56基因核苷酸序列与来自GeneBank中的16株不同型Ot相应片段的序列进行同源性分析, 表 4显示, 楚雄州4份样本与Kato、Karp、Kawasaki、Divergent和Gilliam型代表株的核苷酸(氨基酸)同源性分别为81.21%~100%(72.75%~100%)。其中CX1601和CX1604与5株Kato型菌株(KM03、Akita-7、HC0605a、Kato和Omagai)的核苷酸(氨基酸)同源性为91.88%~100%(92.38%~100%), 而与其他型仅为81.21%~89.82%(78.60%~86.25%)；CX1602和CX1603与5株Gilliam型菌株(LaoUF366、Taiwan、Neimeng-65、TPC0707a和Gilliam)的核苷酸(氨基酸)同源性为92.56%~98.81%(86.25%~98.15%), 与其他型仅为83.60%~88.53%(72.75%~79.73%)。同源性分析结果表明, 楚雄州的CX1601和CX1604样本属于Kato型, CX1602和CX1603属于Gilliam型。
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本次获得的CX1601、CX1602、CX1603和CX1604的Tsa56基因核苷酸序列与来自GeneBank中的16株不同型Ot相应片段的序列构建系统发育树, 图 4显示, CX1601和CX1604序列与5株Kato参考株同在一个进化分支, 具有较近的亲缘关系, 而与其他4个型参考株亲缘关系较远；CX1602和CX1603与5株Gilliam型参考株同为一个进化分支, 具有较近的亲缘关系, 尤其与老挝株(LaoUF 366)和我国台湾株(TPC0707a)亲缘性更近, 与其他4个型参考株亲缘关系较远。进化分析结果与核苷酸(氨基酸)序列的同源性分析结果一致, 进一步论证了楚雄州的CX1601和CX1604为Kato型, CX1602和CX1603为Gilliam型。
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| 图 4 云南省楚雄州4株恙虫病东方体与16株各基因型参考株Tsa56基因核苷酸序列系统发育树 Figure 4 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of the Tsa56 gene of 4 strains of Orientia tsutsugamushi from Chuxiong prefecture, Yunnan province, China and 16 reference strains of various genotypes |
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云南省16个州(市)均有恙虫病病例分布和流行, 其主要流行于西部和南部的热带及亚热带地区[5-8], 根据2006－2018年云南省恙虫病疫情数据的统计分析, 发病数居前5位的市(州)依次为保山、临沧、德宏、楚雄和红河哈尼族彝族自治州(市), 属云南省恙虫病主要流行区。近几年, 楚雄州恙虫病的发病数和发病率均呈逐年上升之势, 至2018年达到历史最高峰, 成为该州重要的公共卫生问题。楚雄州恙虫病地区分布具有明显差异, 其中楚雄市为主要流行区, 发病数占全州10个县(市)病例总数的41.64%, 其次为大姚、永仁、南华和双柏县, 其他5个县发病数较少。我国恙虫病存在夏季型和秋季型[11], 云南省主要为夏季型。楚雄州全年均有病例发生, 但7－10月发病数占全年发病总数的88.35%, 表明主要流行季节为夏秋季, 其他季节发病数较少。各年龄组和各职业人群均有发病, 但以中老年居多, 农民为主, 与此类人群常在野外活动和田间劳作容易接触宿主媒介有关。此外, 还发现0~4岁婴幼儿组发病数也较多, 占总病例数的4.43%, 推测可能与农村居室内外鼠、螨较多, 容易导致婴幼儿被恙螨叮咬而感染发病, 相关影响因素尚需进一步调查。
根据细菌分类, Ot属于立克次体目(Rickettsiales)、立克次体科(Rickettsiaceae)、东方体属(Orientia)。Ot具有基因型多样性的特点, 迄今, 已报道的Ot至少有30种基因型[1]。我国主要流行Karp、Kato、Gilliam和Kawasaki型等, 但南方和北方的Ot型别分布有一定差异[1, 11-13]。1980和1990年代采用血清学方法的分型研究证实, 云南省存在Karp、Kato和Gilliam型的流行[5, 14], 随后20多年, 有关云南省Ot流行株的分型研究报道较少。近期, 杨杜鹃等[8]从西双版纳傣族自治州勐海县14例恙虫病患者急性期血液中获得Ot-groEL区核苷酸序列, 同源性和进化分析表明, 这14株Ot均属Kato型。本次对楚雄州4株Ot的同源性和进化分析均表明, 楚雄州存在Kato和Gilliam型的流行, 均为楚雄州首次报道。本次6例恙虫病临床诊断病例的血液标本经PCR检测, 其中4例Ot阳性患者的采血时间为发病后第4~6天, 而2例阴性患者的采血时间为第7~8天, 认为用于病原学检测的恙虫病患者血液标本应尽可能在发病6 d以内采集, 提示随着发病日期的推后, 菌血症滴度可能会逐渐降低或消失。本次未能采集到更多的患者血液标本用于Ot检测, 导致本研究存在一定局限性。为全面了解当地Ot基因型的分布特征, 亟需进一步开展恙虫病患者感染Ot基因型的调查研究。
云南省恙虫病疫源地广泛分布, 黄胸鼠(Rattus tanezumi)和褐家鼠(R. norvegicus)为主要宿主, 寄生在鼠体表的多种恙螨可传播本病, 以往认为地里纤恙螨(Leptotrombidium deliense)为云南省恙虫病的主要传播媒介[5], 但近些年的调查发现, 不同地域生境的恙螨种群构成和优势螨种可能存在差异, 并发现地里纤恙螨在云南省的分布有一定局限性[15]。章域震等[9]于2012年在曲靖市9个县(市、区)采用间接免疫荧光试验检测啮齿动物血清中的Ot抗体, 结果阳性率为7.09%(42/592), 其中黄胸鼠和褐家鼠阳性率分别为10.00%(21/210)和4.95%(18/364)。2009年的调查表明, 楚雄州褐家鼠和黄胸鼠分布广泛, 其中褐家鼠的构成比和密度均较高[16], 提示褐家鼠可能是当地恙虫病的主要宿主。虽然以往调查表明云南省恙螨种类多、分布广[15, 17], 但楚雄州缺乏恙螨调查资料, 为掌握恙虫病宿主媒介分布特点, 今后需要在该州开展鼠类携带Ot的检测及其体表寄生螨的调查, 为该病防控提供科学依据和理论基础。
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