RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指外源或内源的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)经过一系列反应，而后特异性地引起基因沉默的技术。Fire等^[1]将dsRNA注入秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)体内，发现与RNA同源的内源性基因转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，证明dsRNA是秀丽隐杆线虫基因沉默的主要触发因子，这一发现推动了RNAi在生物医学界的发展和应用。2006年诺贝尔生理学或医学奖也因此颁发给了Fire和Mello教授。到目前为止，不同研究领域的科研人员已在小鼠、果蝇(Drosophila)、蚊虫、线虫、真菌及植物等生物中建立RNAi技术，此外，RNAi技术在研究蚊虫抗药性基因和新型灭蚊剂的研发中有着广阔的应用前景。

1 RNAi的作用机制

RNAi技术的核心点是利用非编码小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)分子切割靶标mRNA分子，从而达到部分沉默或完全抑制靶标基因的效果。其主要过程分为以下3个阶段。

siRNA形成阶段：RNaseⅢ家族核酸酶Dicer2(Dcr2)作为外源性siRNA通路的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)，其主要作用是在腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的参与下将dsRNA裂解为由2条21~23 nt碱基配对链组成的siRNA。双链siRNA的特点为5'端磷酸化，另有2个碱基位于3′羟基末端^[2]。此后dsRNA仍能与Dcr2络合进入下一次循环，Dcr2与dsRNA结合蛋白(R2D2)相互作用，将siRNA装入RNase H家族内切酶Argonaute 2(Ago2)中以等待下一阶段的反应^[3]。

RNA诱导沉默复合物的形成阶段：外源导入或胞内加工生成的siRNA与Ago2、Dcr2以及其他蛋白紧密结合，形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。研究发现，RISC复合物中5'末端碱基配对相对不稳定的那条链更容易被保留^[4]，另外1条siRNA单链很快被降解。而后在Mg²⁺和ATP的共同参与下，单链siRNA特异性识别与之配对的靶标mRNA，Ago2内的核酸内切酶自siRNA中点位置处将靶标mRNA迅速切割成小RNA片段并快速降解，从而达到PTGS的效果。

扩增阶段：这一阶段以mRNA为模板，siRNA为特异性引物，在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)的作用下生成新的dsRNA。新生成的dsRNA又进入起始阶段，被Dcr2切割为次生siRNA进入下一循环，随着大量的siRNA的生成会产生逐级放大效应，以达到快速高效降解mRNA的作用。

2 dsRNA或siRNA导入方法

目前将dsRNA或siRNA导入目标物体内的方法主要有以下几种。

2.1 浸泡法

将目标物浸泡在提前配置好的dsRNA或siRNA的溶液中，是一种较为简便的导入方法，但因dsRNA或siRNA溶液的浓度较难把控，目前仍没有文献对浸泡法dsRNA溶液浓度要求给出明确的参考和意见，因此，本方法在蚊虫防治工作的研究中较少使用。

2.2 喂饲法

主要分为2种途径，一种是将dsRNA溶液滴到成蚊3对足之间，成蚊通过口器将dsRNA溶液送进肠道，也称为局部喂饲法^[5]；另一种是将dsRNA添加到蚊虫的食料中，让蚊虫主动吸食食料以达到吸收dsRNA的效果。总的来说，喂饲法是导入dsRNA的方法中最为高效和便捷的，也是研究人员最常使用的方法。至今，喂饲导入法已经成功地应用于至少15种不同的物种，从农业害虫到人类寄生虫^[6]，如Yu和Killiny^[7]通过喂饲法对亚洲柑橘木虱(Diaphorina citri)的谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)DcGSTe2和DcGSTd1基因进行RNAi后沉默，结果该虫对甲氰菊酯和噻虫嗪杀虫剂的抗药性显著降低。该研究结果可以应用到蚊虫抗药性基因的研究中。但其存在的弊端也较为明显，即通过喂饲法来传递dsRNA会导致一些系统性的基因沉默，影响实验判断^[8]。

2.3 显微注射法

将dsRNA或siRNA在镜下通过显微注射器导入到目标物体内，然后再选取最有效的活性dsRNA为之后的干扰实验做准备^[9]。显微注射法存在一个较大的缺陷，有研究报道注射后会对蚊虫造成明显损伤，仅有体型较大的蚊虫在注射后有较高的存活率。由于显微注射法的应用仅限于实验室的基础实验，我们的研究重点和最后的目的是将RNAi技术应用于蚊虫的防治，因此在保证蚊虫正常生命活动的情况下发挥其最大的干扰效果就显得尤为重要。

3 RNAi在蚊虫防治工作中的研究进展

RNAi具有较高的特异性，在蚊虫抗药性基因^[10]、抗蚊媒病毒感染^[11]以及蚊虫的防治^[12]等方面都有较好的应用，RNAi被认为是一种新的、高效的蚊虫防治研究方法。

3.1 RNAi在蚊虫抗药性方面的应用进展

世界卫生组织(WHO)称在媒介蚊虫防治的工作中，最大的障碍莫过于蚊虫抗药性的增加，近些年来，研究人员对蚊虫抗药性的研究进展迅速。了解蚊虫抗药性的机制是克服抗药性问题的重要一步。高通量全基因组测序、dsRNA介导的RNAi、单核苷酸多态性测定等技术在全基因组水平上被广泛用于鉴定抗性基因和研究杀虫剂介导的抗药性机制^[13]。已有学者用RNAi验证了一些与抗性有关的基因，强调了RNAi技术在理解蚊虫杀虫剂抗性进化中的应用。如Lumjuan等^[14]通过沉默GSTs基因，研究了其与埃及伊蚊(Aedes aegypti)抗药性的关系，认为GSTs基因的转录增加和等位基因的突变都可能导致埃及伊蚊对滴滴涕(DDT)的敏感性降低。

目前，用于公共卫生目的的神经毒性杀虫剂主要有4类，普遍认为拟除虫菊酯是对抗病媒生物最有效和最安全的杀虫剂^[15]。拟除虫菊酯作用的靶点为电压门控钠离子通道(voltage-gated sodium channel，VGSC)^[16]，这种杀虫剂作用原理是使神经元膜上的VGSC保持开放状态，刺激神经细胞重复放电，最终导致蚊虫瘫痪和死亡^[17]。利用针对VGSC基因的dsRNA，能够诱导产生持久的基因沉默效应，并能导致蚊虫对拟除虫菊酯类药物的敏感性升高。遗憾的是，这种沉默效应并没有遗传到蚊虫子一代体内，这可能是由于包括蚊虫在内的昆虫体内缺乏RdRp活性，从而导致dsRNA随着时间的推移而降解^[18]。Bona等^[10]以埃及伊蚊成虫的VGSC422基因为模板，利用含有T7启动子序列的特异性引物合成dsRNA序列，经过dsRNA处理，发现经VGSC422 dsRNA处理的抗性种群对拟除虫菊酯的敏感性比空白对照组提高了约50%，证明了敏感性的升高与在成蚊体内进行VGSC基因沉默有关。

3.2 RNAi在蚊虫抗病毒感染中的研究进展

蚊虫是多种病毒的传播媒介，如登革病毒^[19]、流行性乙型脑炎病毒^[20]等，它们对人类的健康和社会的发展造成了严重危害，因此，使用不同的防治策略以控制蚊媒病毒的传播和感染成为从事媒介防控人员的工作重心。RNAi作为蚊虫主要的病毒特异性先天免疫应答机制，它在蚊虫抗病毒免疫中起着核心作用^[21]。当蚊虫体内的RNAi进入到效应阶段时，siRNA的1条链被降解，另外1条链引导RISC与病毒目标序列互补结合，从而导致病毒复制过程中产生的病毒RNA快速断裂并降解^[22]。同时需要指出的是，RNAi在抑制病毒复制的同时，并不会导致宿主细胞死亡^[23]。

以受到广泛关注的埃及伊蚊及其所传播的登革病毒为模型展开讨论。登革病毒与其他蚊媒病毒一样，能够引起培养的蚊虫细胞以及成年雌蚊的持续感染。通过对Dcr2、Ago2和R2D2的暂时性RNA沉默，研究人员证实了RNAi在介导dsRNA诱导的抗蚊媒病毒中的作用^[24]。将其与上述酶类的编码基因同源的长dsRNA注入到蚊虫体内后，发现Dcr2、Ago2和R2D2作为外源性siRNA通路的关键成分，对限制登革病毒Ⅱ型(DENV-Ⅱ)RNA的积累以及病毒在蚊虫体内的感染和传播至关重要^[25-26]。特别是Dcr2沉默后，DENV-Ⅱ滴度增加了10倍，外部潜伏期从10 d减少到7 d^[25]。

piRNA(PIWI-interacting RNA)是目前被广泛接受的另外1条参与抑制蚊媒病毒的通路。该通路没有Dicer家族基因参与piRNA的生物发生^[27]，且Piwi4是参与这条通路的关键介质，但它不参与病毒特异性piRNA的产生。Varjak等^[28]通过敲除埃及伊蚊Dcr2基因，发现Ago2失去了与siRNA结合的能力，因此不再具有抗病毒活性。而在没有siRNA通路的情况下Piwi4仍然保持了抗病毒活性。这一结果表明埃及伊蚊中siRNA和piRNA通路之间存在复杂的相互作用，且Piwi4可能独立于这2种途径而产生抗病毒效应。

3.3 RNAi在蚊虫治理工作中的应用进展

从事蚊媒治理的研究人员工作的出发点和落脚点是将RNAi技术更好地应用于蚊虫数量的控制，于是近几年关于应用RNAi技术防治蚊虫的报道层出不穷。不育昆虫技术(SIT)是一种非杀虫控制方法，通过释放不育的雄蚊，这些雄蚊寻找野生雌蚊并与之交配，以降低后代蚊虫的繁殖^[29]。Whyard等^[30]将雄蚊睾丸特异性gas8基因的dsRNA与靶向dsxF基因的dsRNA结合，导入埃及伊蚊的幼虫体内，发现发育成熟的几乎都是雄蚊(占96%)，其中绝大多数是不育的。除此之外，Carpenter等^[31]通过RNAi技术沉默表达Tor(tor target of rapamycin)激酶的基因，降低了卵黄原蛋白的表达量，直接导致雌蚊卵子的生成受到抑制。由此可见，RNAi介导的蚊虫防治技术已经有了较好的理论基础和实验室技术发展，这为以后的野外蚊虫治理提供了较好的指导价值。

昆虫角质层是一种结构复杂的外骨骼，覆盖于暴露在外的组织之上，以保护昆虫免受不利环境条件的侵害，并且参与维持运动^[32]，它也是杀虫剂渗透到蚊虫体内的主要途径。Liao等^[33]发现，3，4 -二羟基苯乙醛(DOPAL)合酶(又称多巴醛合成酶)参与埃及伊蚊角质层的降解。Chen等^[34]利用RNAi技术对白纹伊蚊(Ae. albopictus)幼虫和雌蚊DOPAL合酶基因表达产物进行了表征，并对其功能进行了研究。将含有DOPAL合酶dsRNA的纳米颗粒通过喂饲法导入Ⅰ龄幼蚊体内，发现这种酶显著减缓了幼虫到蛹的发育过程。而后他又将DOPAL合酶dsRNA导入到雌蚊体内，雌蚊的死亡率显著上升。这一发现可以推断DOPAL合酶基因在埃及伊蚊幼虫发育过程以及成蚊的存活中发挥关键作用。因此，该基因在未来新型灭蚊剂的探索和研究中存在一定的价值。

4 RNAi与其他生物学方法相结合的应用价值

苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis，Bti)最早是从死亡的淡色库蚊(Culex pipiens pallens)幼虫中分离出来的^[35]，能够在孢子形成阶段产生对蚊虫有剧毒且对环境无害的晶体蛋白。目前，它被认为是用于媒介蚊虫治理中最有效的环保生物制品^[36]。与此同时，利用Bti生产杀虫蛋白的转基因作物在世界范围内已得到广泛种植。诚然，一些害虫已对仅产生1种Bti毒素的转基因作物产生了抗性，而在计算机模拟条件下，与单独使用Bti农作物相比，将Bti毒素和RNAi组合应用的农作物显著降低了Bti抗性。由此可以看出，RNAi作为Bti毒素的有效补充^[37-38]，在害虫的防治中表现出较高的应用价值。

沃尔巴克氏体(Wolbachia)是昆虫和细菌内共生体，可以加强昆虫的免疫系统以限制包括登革病毒和寨卡病毒在内的病毒在其主要媒介埃及伊蚊中的复制。Terradas等^[39]指出，沃尔巴克氏体在限制病毒的复制时，在有RNAi参与的情况下，其抑制效果更加明显，这种将RNAi技术与其他生物学方法相结合而体现出的优越性值得研究人员推广。

5 RNAi技术的局限性

RNAi对细胞内源miRNA的竞争抑制、脱靶效应的存在、体外合成的dsRNA易降解等问题极大地限制了RNAi技术的应用与推广。

siRNA的加工和成熟需要内源性核酸酶Dicer和Drosha等蛋白质因子。因此，当胞内大量生成siRNA时，必然会竞争性抑制内源miRNA的生成，从而影响动植物细胞正常的转录后基因表达调控。即使导入化学合成的外源性siRNA，也会在细胞内和内源miRNA竞争性结合Ago蛋白，从而影响内源性miRNA的正常表达。Khan等^[40]发现，这种竞争效应会表现出浓度和时间依赖性。

脱靶效应的存在是RNAi技术应用时所遇到的最主要问题，是指同一生物体或非目标生物体中非目标基因的沉默，这是由于siRNA与非靶标基因的序列同源性，尤其是其3'UTR区域的序列同源性会导致靶外效应^[41]。有报道称严重的脱靶效应甚至还会导致在应用RNAi技术进行蚊虫功能基因组学研究时得出错误结论，也会因为靶标非特异性的出现而造成严重的环境安全问题，甚至影响人类健康^[42]。

目前，dsRNA在蚊虫体内的稳定性对特异而又持续的RNAi来说仍是一个挑战。一旦进入蚊虫体内，dsRNA必须受到保护，使其免受体内核酸酶的降解，并启动所需基因沉默效应^[19]。有研究报道，在昆虫肠道内的核酸降解酶是昆虫消化混合物的组成部分，而dsRNA是肠道内这些核酸酶的有效底物，因而很容易被它们降解^[43]。据Hakim等^[44]报道，肠道中化学水解效应(随着pH值的增加而增加)和酶在单独或同时存在时，都会影响dsRNA的稳定性。

6 结语与展望

尽管RNAi技术的研究与应用在过去的20年间得到了卓越的发展，但是RNAi技术除上述提到的一些在应用上的局限性外，还存在其他问题阻碍着该技术的推广，如使RNAi效应最大化的dsRNA分子的最适长度犹未可知^[45]、持久的RNAi效应难以维系^[46]、体内细胞和组织之间RNAi的信号传递至今不明等^[47]。

RNAi技术的研究与应用，可为蚊虫的防治和杀灭提供一种更可持续、更环保的新思路。如寻找新的靶标基因，为新型杀虫剂的研发开拓空间，亦或是将RNAi技术与其他生物技术相结合以达到更高效更绿色的灭蚊效果。相信随着分子生物学的不断发展和后人的不断突破，RNAi技术终将会走出实验室，在实际工作中发挥更大作用。