福建省地处东南沿海地区，依山傍水，气候温和，雨量充沛，森林资源丰富，山地、丘陵面积约占全省总面积的90%，适合鼠类动物栖息繁衍，因此，福建省鼠种多样，分布广泛，与人类活动关系密切。鼠类可携带鼠疫、肾综合征出血热(HFRS)、钩端螺旋体病(钩体病)等细菌或病毒性病原体，严重危害人类健康，对鼠种的分类鉴定工作不仅有助于研究鼠类种群及群落特征，而且对鼠传疾病的预防与控制也具有重要意义^[1-2]。长期以来，鼠种鉴定需要依靠经验丰富的专业技术人员根据测量记录的鼠体特征，经检索表查询获得鼠类鉴定结果。但由于鼠体观测过程及对检索表所描述的鼠体特征的理解因人而异，主观性较强，可能出现相同标本经不同鉴定人员鉴定结果不一致的情况，且该方法依赖鉴定人员的专业知识和经验，一般人员经短时间培训后难以胜任，易造成错判误判^[3]。

线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidaseⅠ，COⅠ)基因进化速率适中，片段大小合适，扩增容易，且很少存在插入和缺失，鉴定准确率高，是可用于物种鉴定的目标片段之一^[4-5]。自2003年Hebert等^[6]将COⅠ基因序列应用于动物鉴定并提出DNA条形码的概念后，因其操作简单且对于体貌残缺标本和新种、隐存种的鉴定具有形态学鉴定无法比拟的优势，现已逐步应用于媒介生物检验检疫和生物多样性研究^[7-8]。本文通过对11种福建省鼠类动物的COⅠ序列进行比对分析，旨在探讨COⅠ基因应用于福建省常见鼠类鉴定的可能，以期初步建立鉴定方法，为福建省鼠传疾病防控提供参考。

2017－2018年采用笼日法捕鼠，所有标本均来自福建省各HFRS与钩体病监测点。

所有标本均现场观察并测量体长、尾长、前后足长和毛色等特征信息，参照检索表对鼠种进行鉴定。根据鉴定结果进行分类，常见鼠种挑取10只，数量不足10只的鼠种则全部选用。无菌实验室中解剖鼠体，取肝脏组织，保存于-70 ℃冰箱备用。

肝脏组织剪碎研磨后，根据DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN公司)使用说明书所述方法提取核酸。

正向引物R6036R：5'-ACTTCTGGGTGTCCAAAGAATCA-3'；反向引物BatL5310：5'-CCTACTCRGCCATTTTACCTATG-3'。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应采用25 μl体系：Premix Taq(TaKaRa公司)12.5 μl，正、反向引物各0.5 μl，DNA模板1 μl，双蒸水补足25 μl。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物采用微流控毛细管电泳系统进行检测分析，比对目标条带片段大小。

PCR产物经生工生物工程(上海)股份有限公司测序获得序列信息，经BioEdit 7.0软件剪切校正后，登录美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库，将其序列进行BLAST同源性比对，根据序列相似性选取参考株。在MEGA 6.0软件上分析各鼠种种间和种内遗传距离，并以此为主要依据检验形态学鉴定与DNA条形码鉴定结果的一致性。同时以邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统进化树，自检值设为1 000次。

经形态学鉴定，用于DNA条形码鉴定的77只鼠类标本分属于5属9种，基本信息见表 1。

表 1 实验标本信息 Table 1 Information of all experimental specimens

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77只鼠标本核酸经PCR扩增，成功获得长约750 bp的片段，与目标片段长度相符，经测序获得序列信息。

上述序列经BLAST比对，获得与GenBank上已知鼠种的同源性比对结果，所有样本在数据库中均可找到与之高相似度的已知鼠种，且同源性均在97.88%及以上，同源性最高的白腹巨鼠(Niviventer coninga)可达100%。对卡氏小鼠(Mus caroli)、大足鼠(Rattus nitidus)及标本编号为DT8的白腹巨鼠同源性比对结果与形态学鉴定结果存在差异，其余均符合前期形态学鉴定结果，见表 1。

利用MEGA 6.0软件对所有标本按属分类进行遗传距离分析，各鼠种属内遗传距离在0~11.34%，平均值为5.37%；属间遗传距离则在13.70%~17.90%，平均值为15.96%，见表 2。同属的鼠种间平均遗传距离小于不同属的鼠种间平均遗传距离，且无交叉区间，属间平均遗传距离与属内平均遗传距离之间差值约为3倍。对所有标本的核酸序列进行种内和种间遗传距离分析，结果如表 3所示，鼠种种内平均遗传距离为0.21%，其中最大的是褐家鼠(R. norvegicus)达到0.60%；而鼠种种间平均遗传距离为15.31%，其中最小的是大足鼠与褐家鼠，达到5.82%。种内平均遗传距离与种间平均遗传距离之间差值高达73倍，差异明显。

表 2 福建省不同鼠种属内和属间遗传距离(%) Table 2 The intra- and intergeneric genetic distances (%) of different rodent specimens in Fujian province

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表 3 福建省不同鼠种种内和种间遗传距离(%) Table 3 The intra- and inter-specific genetic distances (%) of different rodent specimens in Fujian province

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采用NJ法建立系统发育树，得到的结果如图 1所示，家鼠属中的黄毛鼠(R. losea)、黄胸鼠(R. tanezumi)、褐家鼠和大足鼠每个鼠种各为一独立分支，且共同聚集成一个大分支；白腹鼠属中的白腹巨鼠、海南白腹鼠(N. niviventer lotipes)和针毛鼠(N. fulvescens)每个鼠种各为1独立分支，且共同聚集成1个大分支；小鼠属(Mus)中的卡氏小鼠(M. caroli)、小家鼠(M. musculus)每个鼠种各为1独立分支，且共同聚集成1个大分支；板齿鼠属(Bandicota)的板齿鼠(B. indica)与巨鼠属(Berylmys)的青毛鼠(B. bowersi)则各为1分支。各分支间无交叉，种间节点支持率高。

图 1 邻接法构建的基于线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)序列系统进化树 Figure 1 Phylogenetic tree constructed by the Neighbor-Joining method based on mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I gene sequence

图选项

综合同源性分析、遗传距离分析和系统进化树图示的结果，本次共77只鼠标本的鉴定工作中，74只鼠标本的DNA条形码鉴定结果与形态学鉴定结果一致，符合率达到96.10%。对3只结果不相符的鼠标本进行形态学方法再鉴定时，发现原形态学鉴定结果有误，更正鉴定结果。

物种间遗传距离差异到何种程度才可以作为区分不同物种的标准，这是决定DNA条形码是否适用于物种鉴定的关键问题^[9]。Hebert等^[10]在对11门共13 320种脊椎动物和无脊椎动物的COⅠ序列研究中提到98%的物种种内平均遗传距离均 < 1%，很少出现>2%的情况，而物种种间平均遗传距离可达11.30%。本次采集的鼠种涵盖了福建省常见的家栖鼠和野栖鼠共5属11种，DNA条形码鉴定结果与传统形态学鉴定结果符合率高(96.10%)。种内平均遗传距离与种间平均遗传距离差异明显(73倍)，且不存在相互交叉的区间，与Hebert等^[10]的研究结论一致。综合同源性比对、遗传距离分析和系统进化树的结果，表明基于COⅠ基因的DNA条形码技术可用于福建省常见鼠种的鉴定和分类工作。

在对鼠标本遗传距离分析中发现，属间遗传距离与属内遗传距离的差异并不明显，且若样本量继续扩大，有存在交叉的可能，而在种的水平上，则差异明显，说明基于COⅠ的DNA条形码技术在鼠种鉴定中，在较低阶元(如种与种之间)的适用性高于高级阶元(如属与属之间)，这与昆虫类的分子系统研究结果一致，可能是DNA条形码在物种鉴定应用中的共性^[11-12]。

在实际工作中，由于鉴定人员认识和经验不足，遇到罕见鼠种或新种时，容易将其鉴定为常见的相似鼠种，而DNA条形码则可有效避免这种主观意识造成的错误，在新种识别上有明显的优势^[13]。如本次实验中，由于福建省卡氏小鼠鲜有报道，近10年内更是没有相关文献可查，鉴定人员对卡氏小鼠认识严重不足，又因为该鼠捕获生境为农舍前田地，与黄毛鼠生境一致，初次形态学鉴定时，将该鼠鉴定为幼年黄毛鼠。但由于DNA条形码鉴定结果为卡氏小鼠，2种方法的结果存在差异引起鉴定人员注意，经查找相关文献资料后^[14-15]，再次进行形态学鉴定，最终确定为卡氏小鼠，更改了原错误的形态学鉴定结果。因此，DNA条形码技术可作为形态学鉴定的补充，提示和修正形态学鉴定中可能出现的错误，以保证鼠种鉴定的准确性^[16]。

作为一种依赖于数据库的物种鉴定新方法，DNA条形码技术尚存在一些缺陷，例如存在属间差异较小、DNA条形码数据库不完善等因素造成的鉴定不准确的可能^[17]。在现有的数据库条件下，将DNA条形码与传统形态学鉴定方法有机结合起来，充分发挥两者的优势，才能更准确有效地应用于鼠种鉴定中。