白纹伊蚊（Aedes albopictus）在我国分布广泛，北至辽宁省，南至海南省，西至西藏自治区，且其在西北地区的分布区有向西扩展的倾向^[1-4]。白纹伊蚊可传播登革热、基孔肯雅热与寨卡病毒病等多种重要传染病^[5-7]。其主要的防控措施包括清理积水容器、使用杀蚊幼剂和使用成蚊控制杀虫剂进行空间喷洒和滞留喷洒等。然而，随着化学杀虫剂的长期大量使用，白纹伊蚊抗药性随之发生和发展，同时，媒介蚊虫伴随人类频繁流动而被动扩散，种群的基因流动性加强，促使抗性基因扩散，抗药性问题已成为全球白纹伊蚊防制的重大障碍^[8]。

乙酰胆碱酯酶（acetylcholinestrase，AChE）是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标，由乙酰胆碱酯酶基因（ace）编码^[9]。有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂通过共价磷酸化或氨基甲酰化AChE活性位点的丝氨酸残基而抑制酶活性，使乙酰胆碱在突触间的作用时间延长，引起突触后膜乙酰胆碱受体超兴奋，通过干扰胆碱能突触而引起神经系统的严重障碍，从而达到杀虫目的。ace基因发生突变导致AChE对杀虫剂的敏感度下降，从而产生抗药性^[10]。淡色库蚊（Culex pipiens pallens）和冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）的AChE均由双基因编码^[11-12]，埃及伊蚊（Ae. aegypti）、斯氏按蚊（An. stephensi）、脉毛蚊（Culiseta nipponica）的AChE则由单基因编码^[13]。白纹伊蚊AChE由单基因ace-1编码^[14]。ace基因靠近活性中心的G119位点甘氨酸（Glycine，Gly）被丝氨酸（Serine，Ser）替代，是昆虫体内较为经典的突变位点，已在多种蚊虫中得到鉴定。对野外淡色库蚊和中华按蚊（An. sinensis）种群研究发现ace基因的Gly-119-Ser型突变，表现出对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂产生高抗药性^[15-16]。

目前，关于白纹伊蚊ace基因及其突变的研究甚少。白纹伊蚊ace基因是否存在Gly-119-Ser突变，以及该突变与有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂抗性的关系如何，都尚未可知。2018年，本课题组通过分析全国病媒生物抗药性监测系统中的抗药性监测资料，并结合中国知网与万方数据库中的抗药性监测数据，筛选出生物测定结果显示，对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂已经产生可疑或低度抗性、中度或高度抗性的白纹伊蚊地理种群。本研究以此为实验材料，对其ace基因进行突变检测，以进行白纹伊蚊对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂抗药性机制的初步探索。

2018年6－9月，在海南省海口市、广东省广州市、云南省景洪市和贵州省兴义市范围内的14个采样点，使用勺捞法采集白纹伊蚊幼蚊、蛹，使用背负式吸蚊器采集白纹伊蚊成蚊，共采集蚊虫422只。采集点详细信息如表 1所示。

表 1 2018年6－9月白纹伊蚊野外种群采集信息 Table 1 Information on the collected field populations of Aedes albopictus from June to September 2018

表选项

DNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，2×Taq PCR预混液购自北京全式金生物技术有限公司，引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

一方面，依据白纹伊蚊成蚊中胸盾片具有中央银白纵条这一形态学特征对成蚊进行鉴定；另一方面，采用张恒端^[17]设计的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）引物对白纹伊蚊全基因组核酸进行扩增后测序，依据测序结果对幼虫和蛹进行鉴定。COⅠ引物信息如下：正向引物COⅠ F：5′-GGC CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′，反向引物COI R：5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′。PCR反应体系中包含2× Taq PCR预混液12.5 μl，10 μmol/L正、反向引物各1 μl，DNA模板2 μl，加双蒸水至25 μl。反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 60 s，51 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共35个循环；72 ℃ 8 min，4 ℃保存。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，条带清晰无拖尾的PCR产物送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行反向测序。

经形态学或分子生物学方法鉴定为白纹伊蚊的单只蚊虫样本，利用磁珠法微量组织基因组DNA提取试剂盒Ⅱ（预封装）提取基因组DNA。

以基因组DNA为模板扩增ace基因的部分片段。扩增引物信息为正向L119：5′-CTG TTC GAA TTG TAG ATG CCG A-3′，反向R119：5′-TCC CAA ACT AGC CAC ACG AT-3′。PCR反应体系中包含2× Taq PCR预混液12.5 μl，10 μmol/L正、反向引物各1 μl，DNA模板2 μl，加双蒸水至25 μl。反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃ 8 min，4 ℃保存。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，条带清晰无拖尾的PCR产物送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行反向测序。测序引物为反向R119：5′-TCC CAA ACT AGC CAC ACG AT-3′。

应用Seqman、MEGA 7.0软件对测得的序列进行比对和峰图分析，观察各位点突变情况，确定等位基因类型和基因型，用Excel 2016软件统计和计算各采集地试虫ace基因的等位基因和基因型频率。

对海口、广州、景洪和兴义市范围内14个地理种群的白纹伊蚊ace基因进行检测，共获得422条DNA序列，在GenBank上进行BLAST对比，与白纹伊蚊ace基因序列一致性达99.00%（AB210122.1），证实所得为白纹伊蚊ace基因部分片段。对序列进行比对分析发现，G119位点存在单个碱基突变（图 1），并未观察到相应的氨基酸替换。G119位点只有1种基因型，即野生型纯合子G/G（422/100%）。

注：A.野生型纯合子（GGA/GGA）；B.野生型杂合子（双峰：GGA/GGG）；C.野生型纯合子（GGG/GGG）；GGA、GGG.为编码甘氨酸的密码子；G/G.为基因型；“/”线前后为该个体的2个等位基因对应的氨基酸；G.为甘氨酸。 图 1 白纹伊蚊ace基因测序图谱 Figure 1 Sequence map of the ace gene of Aedes albopictus

图选项

422只白纹伊蚊样本中，其ace基因G119位点共观测到2种等位基因型。其一是编码甘氨酸的野生型GGA/G，等位基因型频率高达98.58%；另一种也是编码甘氨酸的野生型GGG/G，这种情况较少见，其等位基因型频率为1.42%。观测到野生型GGG/G等位基因的种群为海口市横沟村（3/7.14%）、永兴镇（2/4.55%）和云龙镇（5/7.81%），以及贵州省兴义市（2/3.12%）。在以上的14个野外白纹伊蚊种群中，并未观测到编码丝氨酸的野生型等位基因AGC/S，见表 2。

表 2 白纹伊蚊ace基因G119位点基因型、等位基因型及频率 Table 2 Genotype and allele frequencies at G119 of the ace gene of Aedes albopictus

表选项

ace 基因G119位点的Gly-119-Ser突变已经在多种蚊虫中检测到。李春晓等^[18]的研究证实ace基因的敏感性降低与淡色库蚊抗性种群的抗性形成有关；冈比亚按蚊、尖音库蚊（Cx. pipiens pipiens）和致倦库蚊（Cx. pipiens quinquefasciatus）中也发现了该突变现象^{[11, 19]}。

但是，本研究对白纹伊蚊ace基因进行检测，仅发现个别样本出现单个碱基突变，并未观测到相应的氨基酸突变。张恒端^[17]对南京市白纹伊蚊ace基因进行扩增后测序，在残杀威抗性种群中也未检测到Gly-119-Ser突变。究其原因，可能与白纹伊蚊ace基因G119位点编码甘氨酸的密码子是GGA，若要发生甘氨酸与丝氨酸的替代，需要1个以上的碱基发生改变才能突变为编码丝氨酸的密码子AGC，所以发生概率低^[14]。现有研究结果表明，我国白纹伊蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂已经产生了严重的抗药性。有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂作为白纹伊蚊防控的后备军，应用前景广阔。因此，探究白纹伊蚊对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗药性分子机制，极为紧迫和必要。本研究结果提示，或许今后，我们可以着眼于非特异性酯酶（ESTs）和谷胱甘肽-S-转移酶等代谢抗性酶系基因的研究，进而阐明白纹伊蚊对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性机制。