中国媒介生物学及控制杂志  2020, Vol. 31 Issue (1): 41-45
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蜱是一类专性暂时性营体外寄生于陆生脊椎动物的节肢动物，可寄生的生物包括哺乳类、鸟类、爬行类以及两栖类动物[1]。据报道，有超过16种人类疾病和19种动物疾病是由蜱叮咬或直接传播导致，包括森林脑炎、新疆出血热、Q热和莱姆病、人粒细胞无形体病、发热伴血小板减少综合征以及巴尔通体病等多种人畜共患疾病[2-3]。蜱是仅次于蚊虫的疾病传播媒介[4]，目前，已知约90种蜱可传播病原体[5]，是威胁人和动物健康的重要病媒生物[6]。利用形态学和分子生物学结合的方法对蜱进行鉴定，特别是对破损的、缺乏形态特征的以及处于不同生活史周期的样本，结合DNA条形码技术可将大多数蜱准确分类到种[7-8]。在此基础上研究其可能传播的疫病，可为蜱传疾病的风险做出科学预警和评估。
蜱可以通过人员流动、货物运输、动物引进等多种载体跨境传入[9]，我国大幅增长的进口贸易量也加剧了虫媒病传入的风险。近年来，我国口岸检疫人员多次从进口动物皮毛、皮张中检出亚洲璃眼蜱（Hyalomma asiaticum）、盾糙璃眼蜱（Hy. excavatum）、绚丽花蜱（Amblyomma pomposum）以及囊形扇头蜱（Rhipicephalus bursa）[10-14]。2018年上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心监测了南非进口羊毛携带蜱情况，发现其优势种类为伊文斯扇头蜱（Rh. evertsi）[15]。本研究监测了吉尔吉斯共和国进口羊毛携带蜱情况，发现其优势种类为具沟血蜱（Haemaphysalis sulcata），并且发现了拉合钝缘蜱（Ornithodoros lahorensis）活体。因此，对不同国家进口羊毛的监测，可以了解其携带蜱的优势种类，以及可能传播的疫病，以达到预警的目的。为方便相关人员了解吉尔吉斯共和国进口羊毛携带蜱情况，我们对监测情况，拉合钝缘蜱、具沟血蜱的形态学和分子生物学鉴定方法以及传播病原体等信息进行了介绍。
1 材料与方法 1.1 材料2017年9月至2018年6月从新疆维吾尔自治区（新疆）吐尔尕特口岸进口的16批次吉尔吉斯共和国羊毛，按照GB/T18088－2000《出入境动物检疫采样》要求采样，其中11批次分别从绵羊毛和山羊毛中检出蜱，共计39只。
1.2 方法 1.2.1 形态鉴定将虫体取出，利用显微镜（ZEISS Discover.V20，德国）进行形态学鉴定，形态学术语参照文献[16]，对鉴别特征拍照后置于装有95%乙醇溶液的1.5 ml离心管中保存。
1.2.2 DNA提取在解剖镜下取蜱的1个足，放入1.5 ml离心管中，加入液氮研磨后，利用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒（Qiagen，德国）提取样品基因组DNA。
1.2.3 PCR扩增硬蜱采用线粒体16S rRNA基因[17]和细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因[18-19]进行扩增，软蜱采用线粒体16S rRNA基因、COⅠ基因和18S rRNA基因[20]进行扩增，引物序列见表 1。16S rRNA基因PCR扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，52 ℃复性30 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环；72 ℃延伸8 min。COⅠ基因PCR扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，45 ℃复性60 s，72 ℃延伸60 s，共40个循环；72 ℃延伸8 min。18S rRNA基因PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性15 s，48 ℃复性50 s，68 ℃延伸60 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，通过凝胶成像系统进行拍照分析，并将目的基因片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
将线粒体16S rRNA、COⅠ和18S rRNA基因的测序结果在美国国立生物技术信息中心（NCBI）的GenBank上进行同源性比对以确定蜱的种类。
2 结果 2.1 鉴定结果经形态学和分子生物学鉴定，所截获的39只蜱隶属于2科4属5种，分别为拉合钝缘蜱、亚洲璃眼蜱、边缘革蜱（Dermacentor marginatus）、刻点血蜱（Ha. punctata）和具沟血蜱（表 2）。其中具沟血蜱30只，占截获蜱总数的76.9%，为本次吉尔吉斯共和国进口羊毛携带蜱的优势种类。另外，首次在进口羊毛中检出拉合钝缘蜱若蜱活体1只。
若蜱形态特征见图 1，体呈卵圆形，两侧缘近平行，前部尖窄，形成锥状顶突，后缘宽圆；背部表皮呈皱纹状，密布星状小窝，躯体前半中央有1对长形盘窝，中部有4个圆形盘窝，排列成四边形，后部还有3~4对圆形盘窝；假头基中等大小，无生殖孔；口下板较发达；足跗节Ⅰ背缘有3个粗大的瘤突[17]。
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| 注：A.背面观；B.腹面观。 图 1 拉合钝缘蜱若蜱 Figure 1 Body of the nymph of Ornithodoros lahorensis |
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雄性成虫形态特征见图 2，假头基背面侧缘直，平行，腹面两侧具不规则的横向褶皱，侧缘直，基突长明显超过基部之宽，末端较尖，向内微凹，后缘弧形；须肢第Ⅱ节后外侧缘弧形，内缘具窄叶状密集排列的刚毛；第Ⅲ节三角形，前端具窄三角形角突，内侧缘聚2根窄叶状刚毛；口下板长度与须肢长度相当，前端具密集的小齿，齿式5/5。盾板前1/4处水平侧缘弧形内凹，颈沟前段短而深陷；缘垛9枚。生殖区较大，位于基节Ⅱ中部水平；肛门瓣后缘角状向后突出；气门板圆形，背突较长而尖。足基节Ⅰ内距细锥形，稍弯向外侧，末端较尖，超过第Ⅱ节前缘；基节Ⅱ、Ⅲ内距形状相近，较小而不明显，末端圆钝，刚超过后缘；基节Ⅳ内距发达，长锥形，长度近似基节Ⅳ之宽，末端稍向外弯；跗节均较短，跗节Ⅰ末端腹面具极小的尖刺，爪垫长，几乎达到爪端；跗节Ⅳ末端腹面具三角形刺突[5]。
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| 注：A.背面观；B.腹面观。 图 2 具沟血蜱雄性成虫 Figure 2 Body of the male adult Haemaphysalis sulcata |
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雌性成虫形态特征见图 3，假头基背面侧缘直，近于平行，腹面广阔，侧缘直，向后渐窄，基突圆钝，后缘波浪形；孔区斜置，竖卵圆形。须肢后外角圆角状突出；下口板较须肢稍短，前端具密集小齿，齿式5/5，向后递减至2/2。盾板近圆形或盾形，侧缘圆弧形；刻点小至中型，多而密，假盾区缘垛9枚。生殖区位于基节Ⅱ中部水平，气门板近椭圆形，背突短。足基节Ⅰ内距锥形，长近于基部之宽，末端稍尖；基节Ⅱ、Ⅲ距小，不明显；基节Ⅳ内距较基节Ⅱ、Ⅲ稍大，末端圆钝；跗节Ⅰ末端腹面具小型尖刺，爪垫长为爪长的2/3；跗节Ⅳ末端腹面具较长的尖刺[5]。
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| A.背面观；B.腹面观。 图 3 具沟血蜱雌性成虫 Figure 3 Body of the female adult Haemaphysalis sulcata |
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拉合钝缘蜱和具沟血蜱的PCR产物经凝胶电泳检测得到与目标片段16S rRNA（420~460 bp）、COⅠ（680~720 bp）和18S rRNA（780~800 bp））大小一致的条带，电泳结果见图 4。
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| 注：M. DNA Marker；1~4.拉合钝缘蜱16S rRNA、COⅠ、18S rRNA基因PCR扩增产物和阴性对照；5~7.具沟血蜱16S rRNA、COⅠ基因PCR扩增产物和阴性对照。 图 4 拉合钝缘蜱和具沟血蜱PCR凝胶电泳检测结果 Figure 4 Results of PCR gel electrophoresis of Ornithodoros lahorensis and Haemaphysalis sulcata |
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将扩增的线粒体16S rRNA、COⅠ和18S rRNA基因目标条带分别测序，并在NCBI数据库中进行同源性比对，再利用MEGA 7.0软件构建系统发育树（Neighbor-Joining，NJ）。结果显示，所截获的软蜱（Ornithodoros sp.1）为拉合钝缘蜱，硬蜱（Haemaphysalis sp.2）为具沟血蜱（图 5~7）。
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| 注：Ornithodoros sp.1和Haemaphysalis sp.2为本次截获的蜱。 图 5 拉合钝缘蜱和具沟血蜱16S rRNA系统发育分析 Figure 5 Phylogenetic analysis of 16S rRNA of Ornithodoros lahorensis and Haemaphysalis sulcata |
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| 注：Ornithodoros sp.1和Haemaphysalis sp.2为本次截获的蜱。 图 6 拉合钝缘蜱和具沟血蜱COⅠ系统发育分析 Figure 6 Phylogenetic analysis of COⅠof Ornithodoros lahorensis and Haemaphysalis sulcata |
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| 注：Ornithodoros sp.1为本次截获的蜱。 图 7 拉合钝缘蜱18S rRNA系统发育分析 Figure 7 Phylogenetic analysis of 18S rRNA of Ornithodoros lahorensis |
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2017年9月至2018年6月从新疆吐尔尕特口岸进口的吉尔吉斯共和国羊毛16批次，有11批次检出蜱，说明从该国进口的羊毛携带蜱的概率较高。检出的39只蜱中有30只为具沟血蜱，占截获蜱总数的76.9%，表明具沟血蜱为吉尔吉斯共和国进口羊毛携带蜱的优势种类。通常从羊毛中检出的蜱均为死蜱，活蜱较少，软蜱更是少见。本研究检出的活体软蜱为拉合钝缘蜱若蜱，为国内首次报道。口岸监管部门对羊毛采取了有效检疫处理措施，降低了外来物种传入和定殖的风险，并加强了进口羊毛的检疫。
3.2 拉合钝缘蜱及具沟血蜱的分布及危害拉合钝缘蜱也称拉合尔钝缘蜱，主要分布于中国新疆、中亚、俄罗斯、格鲁吉亚、乌克兰、巴基斯坦、阿富汗和伊朗等国家和地区[21]。该蜱的主要宿主包括绵羊、山羊、骆驼、牛和家犬等，也袭击人。成蜱耐饥能力强，可达5~6年。可自然感染Q热、北亚斑点热立克次体、土拉弗朗西斯菌、布鲁氏菌，也传播家畜边虫病及引起蜱瘫痪，还可传播牛羊焦虫病、骆驼锥虫病、兔热以及非洲猪瘟等多种疾病[21-23]。具沟血蜱主要分布于中国新疆、中亚、西亚、俄罗斯、欧洲以及非洲部分地区[23]。该蜱的主要宿主包括绵羊、山羊、牛、骆驼等，主要传播绵羊无浆体，引起无浆体病[24]。
所截获的蜱是否携带病原微生物还有待进一步检测。总之，加强进口羊毛检疫，对预防外来生物入侵，降低疫病传入的风险具有重要意义。
志谢 中国农业科学院兰州兽医研究所陈泽教授在标本的形态学及分子生物学鉴定中给予指导，特此志谢| [1] |
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表1(Table 1)
