人类自身行为和自然环境的改变对传染病的发生和流行造成了巨大影响。据报道，我国输入性传染病种类已经由2005年的2种增加至2016年的11种^[1]。新传染病不断出现，旧传染病死灰复燃，输入性传染病已成为我国主要的公共卫生问题。蚊虫作为多种传染病的传播媒介，其有效监测和控制是传染病疾病管理全球战略的一个非常重要的组成部分，而化学杀虫剂的应用在蚊虫综合治理方面做出了巨大贡献。但由于杀虫剂的广泛使用，对蚊虫起到了选择作用，导致其杀虫剂抗性的产生与发展。

目前已经公认的蚊虫抗药性机制主要有4种，即靶标抗性、代谢抗性、行为抗性和表皮抗性^[2]。细胞色素P450（cytochrome P450，P450）作为蚊虫体内多功能氧化酶系（MFO）的末端氧化酶，其介导的杀虫剂抗性作为代谢抗性最主要的机制之一，参与了蚊虫对有机氯类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、有机磷类、新烟碱类等杀虫剂的代谢解毒。现对蚊虫抗药性相关的P450的研究进展进行综述。

1 P450介导的蚊虫抗药性特点

P450能够与底物结合并将电子由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH/NADH）传递到NADPH细胞色素P450还原酶（CPR），具有底物广泛性和功能多样性的特点。它不仅参与内源性生理物质（信息素、蜕皮激素、保幼激素）的合成或分解，而且在外源性物质（杀虫剂、植物毒素、环境污染物）的分解或代谢方面起着重要作用^[3]。其介导的代谢解毒作用可显著影响生物体组织中杀虫剂的分布，改变其毒理学效应。

1.1 普遍性

P450介导的代谢解毒作用在蚊虫对有机氯类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、有机磷类、新烟碱类杀虫剂抗性中普遍存在。Chiu等^[4]发现冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）CYP6Z1基因的过度表达造成了其对滴滴涕（DDT）的抗性，通过同源性建模和分子对接证明CYP6Z1蛋白具有代谢DDT的作用。Ishak等^[5]发现马来西亚白纹伊蚊（Aedes albopictus）CYP6N3基因在DDT和氨基甲酸酯类抗性群体中始终过度表达，而CYP6P12基因的过度表达与拟除虫菊酯抗性密切相关。公茂庆等^[6]利用实时荧光定量PCR（qPCR）和反转录PCR（RT-PCR）技术发现淡色库蚊（Culex pipiens pallens）溴氰菊酯抗性种群中CYP6F1基因的表达水平高于敏感品系，且CYP6F1基因在淡色库蚊的不同发育时期表达不同，结果提示CYP6F1可能与溴氰菊酯抗性有关。Yahouédo等^[7]通过qPCR对冈比亚按蚊转录水平进行分析显示，CYP6M2和CYP4G16在拟除虫菊酯类杀虫剂暴露后表达水平上调，同时后者可以调节表皮羟类物质的含量来改变表皮结构以延缓杀虫剂的吸收。Ishak等^[8]又对马来西亚埃及伊蚊（Ae. aegypti）抗性种群进行全基因组微阵列转录分析，结果显示与解毒作用有关的CYP9J27、CYP6CB1、CYP9J26和CYP9M4过度表达，但qPCR并不支持这一结果，CYP6CB1表达水平并未明显升高。这2种方法之间的差异可能是由于微阵列探针序列和qRCR引物序列不同所致。Stevenson等^[9]利用大肠埃希菌异源表达分析表明，CYP6CB1并不能代谢拟除虫菊酯，并且埃及伊蚊抗性种群体内存在CYP9JS过转录的现象，其中CYP9J32、CYP9J24、CYP9J26和CYP9J28参与代谢溴氰菊酯和氯菊酯。Goindin等^[10]在对法国西印度群岛地区埃及伊蚊研究时发现，该地区埃及伊蚊种群已对多种杀虫剂产生不同的抗性，其对双硫磷表现出高抗性。这种高抗性与CYP6M11基因的表达水平显著相关，而与击倒抗性（kdr）突变无关。Riaz等^[11]通过比较埃及伊蚊吡虫啉抗性种群中过转录的多个P450蛋白质、烟粉虱（Bemisia tabaci）CYP6CM1vQ、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）Cyp6G1的底物识别位点和吡虫啉对接模型，发现CYP6BB2和CYP6N12是参与吡虫啉代谢的良好候选基因。

1.2 交互抗性

P450具有底物广泛性的特点，极有可能同时代谢不同类型或作用机制的杀虫剂，赋予蚊虫产生交互抗性的能力^[3]。近年来，蚊虫表现出交互抗性的多样性对标准的杀虫剂抗性管理策略造成挑战，增加了蚊虫化学防治的困难。Nardini等^[12]报道刚果冈比亚按蚊与致死按蚊（An. funestus）体内存在高水平的溴氰菊酯和DDT抗性，这种高水平的抗性是由于CYP6M2与CYP6P1的高表达所导致的交互抗性所引起。在西非蒂亚萨莱地区的冈比亚按蚊CYP6M2基因可导致蚊虫对3种不同类型的杀虫剂产生抗性，除对拟除虫菊酯和DDT表现出抗性外，还通过转基因表达在黑腹果蝇体内产生对恶虫威的抗性。使用增效剂（PBO）可以显著增强恶虫威的杀蚊效率，同时也增强了拟除虫菊酯和DDT的作用^[13]。Ibrahim等^[14-15]发现致死按蚊抗性种群中，CYP6AA1和CYP6Z1基因过度表达明显增多，使蚊虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性，但与主要拟除虫菊酯类抗性基因CYP6P9a和CYP6P9b不同，CYP6AA1和CYP6Z1也具有结合和代谢恶虫威的能力，这使其成为一种潜在的交互抗性基因。Chiu等^[4]将冈比亚按蚊的CYP6Z1基因通过原核表达证明该基因具有代谢DDT和西维因的作用。

2 P450介导的蚊虫抗药性分子机制

P450是生物体内一个十分复杂的酶系，它的表达调控是生物体内、体外多种因素相互作用的结果。研究表明，P450介导的抗药性分子机制涉及P450酶表达量的增加或活性升高，从而导致蚊虫对杀虫剂产生抗性。

2.1 酶表达量的增加

P450酶表达量的增加是其参与蚊虫抗药性的主要方式，而这种过量表达是由杀虫剂、植物次生性化合物（香叶醇）及人工合成诱导剂（苯巴比妥、巴比妥）等物质的诱导所致。在蚊虫中，这些物质对P450的诱导主要发生在转录水平。现有研究表明，P450基因转录水平上的调控会受到顺式作用元件（cis-acting element）和反式作用因子（trans-acting factor）的介导^[16]。

周国理等^[17]从白纹伊蚊溴氰菊酯抗性种群中扩增出CYP6N3上游调控序列，以此序列为基础采用基因步移法克隆出该基因的启动子并获得了该区域内各种顺式作用元件，推测蚊虫分解代谢外源性化合物是通过顺式作用元件与1个或多个P450基因或其等位基因变异体的相互作用进行的。Weedall等^[18]使用GPMiner软件对致死按蚊CYP6P9a/b的启动子区域进行注释分析，发现敲除CCAAT盒和外源性解毒相关的转录因子CncC/MafK结合位点可导致CYP6P9a活性降低89%，因此，CCAAT盒和CncC/MafK结合位点可能是驱动CYP6P9a过表达的关键调节增强因子。此外，由反式作用因子作用而导致P450基因过度表达的情况在蚊虫中也有报道。有报道发现转录因子Maf-S可调控CYP6M2在冈比亚按蚊中的表达，通过RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）敲除Maf-S可降低其转录水平，结果显示显著增加了冈比亚按蚊接触拟除虫菊酯和DDT的死亡率，但接触马拉硫磷的死亡率却是降低的。Ingham等^[19]认为Maf-S可调控1个或多个P450基因，既能代谢解毒，又能激活不同种类的杀虫剂，从而导致冈比亚按蚊CYP6M2对拟除虫菊酯和有机磷之间的负交互抗性。埃及伊蚊CYP6BB2、CYP6Z8、CYP9M5和CYP9M6在SP种群（氯菊酯抗性种群）中过度表达，同时在CKR种群（敏感品系ROCK与SP杂交获得）中亦过度表达，Smith等^[20]认为这4个P450基因的过度表达是由1个能够增加多个P450基因表达的反式作用因子调控的。基于这些结果，顺式作用元件、反式作用因子介导的P450基因转录水平上的调控可能是蚊虫的一种常见杀虫剂抗性机制。

近年来发现基因拷贝数增加也会导致P450酶表达量的变化。Kasai等^[21]通过qPCR比较了埃及伊蚊SP种群和SMK敏感品系（日本住友化学株式会社保存品系）中7个P450基因的拷贝数，结果显示SMK品系P450基因大部分为单一拷贝，SP种群中的CYP6Z7、CYP9M4、CYP9M5和CYP9M6的平均拷贝数分别是SMK种群的3.1、4.3、4.8和4.6倍。Bariami等^[22]获得了加勒比地区埃及伊蚊2种拟除虫菊酯抗性种群（CUBA-DELTA和CAYMAN）的转录组，发现与敏感品系相比，抗性种群CYP9J26的拷贝数大约增加了7倍。这些结果表明，P450在抗性蚊虫中酶表达量增加的机制极其复杂，可能涉及诸如P450基因转录增强、基因拷贝数增加等多个因素的影响。

2.2 酶活性的改变

部分研究表明，P450介导的抗药性可能与氨基酸序列改变有关。CYP6P9a和CYP6P9b基因表达量增加是非洲致死按蚊田间群体对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性的主要因素^[23]。基因定点突变和功能分析表明，CYP6P9b等位基因的3个氨基酸变化（Val109Ile、Asp335Glu和Asn384Ser）是致死按蚊产生拟除虫菊酯抗性的关键^[24]。Irving等^[25]分析了致死按蚊拟除虫菊酯抗性种群中CYP6Z1和CYP6Z3基因的多态性，发现CYP6Z1中存在Y175C、F265I和F416L氨基酸序列的改变，CYP6Z3中存在S219P、E239G和L471F氨基酸序列的改变，这些序列的改变可影响其自身蛋白的催化活性，进而影响致死按蚊对拟除虫菊酯的抗性。这些关键氨基酸的变化有助于研究人员设计基于DNA的诊断工具，以便更好地在实地检测和跟踪这些蚊虫的抗性标记。

3 P450介导的蚊虫抗药性调控途径（以GPCRs为例）

最近的研究表明，G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors，GPCRs）超家族分布于昆虫不同种类的细胞中，其可接受外界刺激，传递信号分子，激活昆虫体内多种信号通路，在昆虫生理中发挥关键作用。蚊虫体内有数量众多的GPCRs，这为人们发展新型选择性杀虫剂或媒介控制提供了很大可能^[26]。

Li等^[27]采用qPCR和功能基因组学方法，首次探讨了GPCRs及其相关基因在致倦库蚊（Cx. pipiens quinquefasciatus）杀虫剂抗性的作用。通过比较抗性种群和敏感品系115个GPCRs相关基因的表达，发现在高抗性种群HAmCq^G8和MAmCq^G6中，分别有1和3个GPCRs相关基因上调。为了说明这些上调的GPCRs相关基因在抗药性中的作用，采用RNAi技术敲除上调的GPCRs相关基因。结果显示，这4个GPCRs相关基因的敲除不仅降低了蚊虫对氯菊酯的抗性，而且抑制了4个杀虫剂抗性相关P450基因的表达，说明GPCRs相关基因参与了蚊虫抗药性P450基因表达的调控。孙艳^[28]以白纹伊蚊GPCRs超家族中的视蛋白基因（Opsin）为研究对象，采用qPCR技术分析Opsin相关的GPCRs信号通路中抑制蛋白（Arrestin）、Gq蛋白α亚基（Gqα）、β型磷脂酶C（PLC_β）基因及CYP6A1在蚊细胞、蚊活体抗性种群和敏感品系中的表达差异，结果提示GPCRs信号通路可能作为一种新的机制参与了蚊虫抗药性的形成，即Arrestin可调控Opsin的表达，从而调节Gqα及磷脂酯（PLC）酶活性，影响CYP6A1基因的表达而导致蚊虫对溴氰菊酯产生抗性。Zhou等^[29]发现淡色库蚊溴氰菊酯抗性种群（DR）视蛋白基因NYD-OP7的表达量是溴氰菊酯敏感品系（DS）的2.2倍，RNAi灭活NYD-OP7基因不仅增加了蚊虫对溴氰菊酯的敏感性，同时还抑制了NYD-OP7/PLC信号通路下游效应分子PLC的表达和酶活性以及多个与抗药性有关的P450基因（CYP4G15、CYP9AL1、CYP9J39、CYP9J40和CYP9J43）的表达。结果提示，NYP-OP7/PLC信号通路可以通过调控P450基因表达来参与杀虫剂的代谢解毒。值得注意的是CYP9J40仅受NYD-OP7调控，其表达不受PLC酶的影响。可能的解释为：GPCRs信号通路与P450的表达调控是一个复杂的网络，除PLC外还有其他下游组分与NYD-OP7相互作用参与P450的表达调控。

近年来随着P450基因表达调控研究已从单基因序列分析发展到全基因组序列分析，从单个基因表达的特征发展到同时检测多个基因的表达，人们发现调控基因和多个P450基因的相互作用可能是产生杀虫剂抗性的原因，蚊虫抗药性形成涉及更广泛的基因和更为复杂的机制^[30]。

4 结语

蚊虫的危害一直是人类面临的一个实际问题，化学防治仍旧是当今蚊虫防治的主要手段。杀虫剂的大量、连续使用导致了蚊虫抗药性的产生和发展，进而加剧了蚊媒传染病的流行。因此阐明蚊虫抗药性机制，研究新的抗药性基因，寻找新的杀虫剂作用靶点成为有效监测和预防蚊媒传染病的前提和必要条件。

细胞色素P450酶系介导的杀虫剂解毒代谢作用的增强是大多数蚊虫对各种类型的杀虫剂产生高水平抗性和交互抗性的主要因素。但由于P450酶系功能的复杂性和多样性，之前大多数研究都是针对杀虫剂的代谢、增效、抗性问题，很少涉及其基因表达调控途径或抗药性分子机制，而且对于P450酶系中的关键组成部分NADPH细胞色素P450还原酶和细胞色素b5的研究也较少^[31-32]。在过去的10年中，新的高通量测序和功能研究技术（RNAi、转基因）的出现，使得在基因组水平上表征P450基因数量和蛋白功能成为可能。目前，冈比亚按蚊^[33]、埃及伊蚊^[34]、致倦库蚊^[35]、白纹伊蚊^[36]等相继完成了全基因组测序工作，不同层次和类别的生物数据库（美国国立生物技术信息中心、VectorBase、InsectBase等）也相继建立，促进了蚊虫结构基因组学和功能基因组学的发展^[37]。未来的研究需要关注抗药性相关的P450调控基因和GPCRs相关基因在杀虫剂抗性中的潜在作用，深入了解P450酶系的表达调控机制、结构与功能的关系，为蚊虫抗性治理提供重要的理论基础，从而全面解析P450介导的代谢抗性机制。