迄今，全世界已发现的蚤类共计3 000余种，隶属5总科16科240多属和亚属。我国已知的蚤类昆虫有655种和亚种，隶属4总科10科74属和亚属^[1]。由于蚤目昆虫成虫个体非常微小，一般为2~3 mm，个别可达10 mm，加之形态学鉴定需要鉴定人员具备丰富的物种分类经验，易造成人为错误，影响鉴定结果。DNA条形码技术是通过碱基的标准化DNA分子序列进行物种识别鉴定的技术^[2]。自2003年Hebert等^[3]提出这一概念后，DNA条形码在生物学各相关领域得到广泛应用。本研究通过使用线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因，对阿拉山口地区几种常见蚤进行分子生物学鉴定，以期明确COⅠ基因在蚤类分类鉴定中的应用前景。

阿拉山口口岸位于我国西部，介于阿拉套山与巴尔鲁克山之间，是目前唯一集铁路、公路、管道原油运输为一体的国家一类陆路口岸。艾比湖湿地自然保护区和夏尔西里自然保护区内野生动物有上百种，其中国家一级保护动物有雪豹、北山羊、金雕等。

2017年5月使用鼠夹法于城区、城郊综合区及野外区3大区域采集鼠类样本，采用动物体表收集法采集寄生在鼠体表的蚤类样本。

依据《中国动物志》检索表^[4]，对蚤类标本进行形态学鉴定。

将蚤标本剪碎，按照DNeasy^® Blood & Tissue Kit（QIAGEN）说明书提取基因组DNA（5匹/组），产物于-20 ℃冰箱保存备用。

PCR扩增引物包括正向引物LCO1490（GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG）和反向引物HCO2198（TAAACTTCAGGGTGACCAAAAA ATCA）^[5]，由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。PCR扩增反应体系为50 μl：其中dNTP（2.5 mmol/L）4 μl、10×PCR Buffer 5 μl、Taq DNA聚合酶（5 U/μl）0.2 μl、引物各1 μl、模板1 μl、ddH₂O补至50 μl，混匀。COⅠ基因扩增参数：95 ℃预变性1 min；95 ℃15 s，55 ℃15 s，72 ℃10 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将得到的扩增产物送至北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司进行测序。

将测序序列进入GenBank进行BLAST同源性检索，使用MEGA 6.0软件，以邻接法（1 000次重复）构建系统发育树。

共采集蚤类139匹，在镜下鉴定为臀突客蚤（Xenopsylla minax，45匹）、长吻角头蚤（Echidnophaga oschanini，16匹）、秃病蚤指名亚种（Nosopsyllus laeviceps laeviceps，21匹）和猫栉首蚤指名亚种（Ctencoephalides felis felis，57匹）。

经PCR扩增以上4种蚤的线粒体COⅠ基因，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，得到685 bp左右的核酸片段，与预期片段大小相符，见图 1。

注：M. DNA Marker；1~4.为臀突客蚤、长吻角头蚤、秃病蚤指名亚种和猫栉首蚤指名亚种样本的PCR产物；5~6.为阴性对照 图 1 中哈边境阿拉山口地区蚤类COⅠ PCR电泳结果

图选项

BLAST分析显示（图 2），长吻角头蚤ALSK-Z053与长吻角头蚤（KM890984）的同源性最高，为99.8%（458/459）；与西班牙E. iberica（KF479239）的同源性为94.4%（611/647），与澳大利亚E. gallinacea（KT376440）的同源性为94.7%（558/589）。臀突客蚤ALSK-Z056与美国X. skrjabini（KM890983）的同源性最高，为95.7%（421/440）；与西班牙X. cunicularis（KF479238）的同源性为88.7%（575/648），与美国同形客蚤指名亚种（X. conformis conformis）（KM890988）的同源性为91.8%（404/440），与美国X. conformis mycerini（KM890903）的同源性为90.6%（415/458）。猫栉首蚤指名亚种ALSK-Z070与澳大利亚猫栉首蚤（JN008917）的同源性最高，为98.9%（622/629），与捷克猫栉首蚤指名亚种（KP684201）的同源性为100%（592/592），与印度猫栉首蚤指名亚种（KP687808）的同源性为99.3%（583/587）。秃病蚤指名亚种ALSK-Z015与N. laeviceps ellobii（KM890985）的同源性为98.8%（407/412），与秃病蚤蒙冀亚种（N. laeviceps kuzenkovi）（KM890987）的同源性为98.1%（404/412）。4种蚤类分子生物学鉴定与形态学鉴定相吻合，中哈边境地区的4种蚤类与国外的蚤类有着高度相似性。

注：▲猫栉首蚤指名亚种；■长吻角头蚤；◆臀突客蚤；●秃病蚤指名亚种 图 2 基于COⅠ基因进行的系统进化树分析结果

图选项

蚤类不仅叮刺人、兽，造成皮肤损害，而且是传播鼠疫和地方性斑疹伤寒等疾病的重要媒介^[6]。因此，在边境口岸地区快速识别蚤类样本，对防控蚤传疾病具有重要意义。近年来，DNA条形码技术已被广泛应用于“隐存种”的发现、残缺标本的鉴定、宿主动物的识别等^[2]。本研究使用COⅠ基因对中哈边境地区蚤类进行分子生物学鉴定，结果显示，除GenBank中无记录外，使用COⅠ基因可以很好的对蚤类标本进行种类鉴定。臀突客蚤ALSK-Z056和秃病蚤指名亚种ALSK-Z015分别与美国X. skrjabini、N. laeviceps ellobii同源性较高，经查阅GenBank数据库发现其中无相关臀突客蚤和秃病蚤指名亚种记录，本研究首次报道了臀突客蚤和秃病蚤指名亚种的COⅠ基因序列。

新疆地处我国西北，边境线长达5 600多公里，周边与8个国家相邻，随着“一带一路”建设的不断推进，阿拉山口口岸成为我国西部国际贸易的“黄金通道”。频繁的贸易往来，便利的交通增加了外来媒介生物输入的风险，口岸地区使用DNA条形码技术将有助于对媒介生物进行快速、准确的鉴定。鉴于DNA条形码数据库处于建设阶段，因此，应广泛收集DNA条形码数据，以满足DNA条形码为基础的快速种类鉴定的需求^[7]。