炭疽是由炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthraci)引起的一种人兽共患传染性疾病。炭疽芽胞抵抗力强，在自然界土壤中可以存活数十年。在发达国家，由于人民生活水平的提高、动物疫苗接种和染疫动物消毒无害化处理等措施的综合应用，炭疽不再循环感染发生。我国还存在炭疽疫源地，牲畜炭疽常年发生，人炭疽病例在四川、贵州、辽宁、陕西、甘肃省以及新疆维吾尔自治区和内蒙古自治区(内蒙古)时有报道，甚至有暴发疫情的发生^[1-2]。为了炭疽预防控制、突发公共卫生事件应对和生物恐怖防范的需要，按照《全国炭疽监测方案》(试行)和WS283－2008《炭疽诊断标准》开展监测工作和病例诊断。2018年8月内蒙古通辽市科尔沁区发生了一起皮肤炭疽疫情，本研究探讨了该次炭疽暴发疫情中炭疽病例诊断的经验与存在的问题。

来源于2018年8月内蒙古通辽市1起炭疽暴发疫情资料。

根据疫情报告，对疑似皮肤炭疽病例采集皮肤破损处渗出液和静脉血标本。采集患者标本时均征得患者口头知情同意，该同意书由通辽市传染病医院的主治医生记录在案。程序符合国家研究委员会的道德标准。

用真空非抗凝采血管采集疑似病例急性期和恢复期静脉血标本，分离其血清-20 ℃保存；皮肤破损处标本采用载玻片直接蘸取和用无菌棉签擦取渗出液。

营养琼脂(北京陆桥GCM107)，青霉素G药敏纸片(爱思微，10μg/片)，炭疽鉴定用噬菌体(批号:20180401)、ELISA检测试剂均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。核酸提取试剂用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit (CatNo. 69504)，炭疽芽胞杆菌核酸荧光PCR检测试剂盒(上海辉睿生物科技有限公司)。

所有采集的样本立即涂片，革兰染色，进行显微镜检查。发现大量两端平齐的革兰阳性大杆菌，即可作为诊断依据。

将样本直接涂布营养琼脂平板和增菌培养，增菌培养后再划线分离培养。37 ℃孵育8~24 h后，检查是否长出可疑的炭疽芽胞杆菌菌落。可疑菌落挑出，划线接种于平板之上用炭疽噬菌体和青霉素纸片进行鉴定。分离到炭疽芽胞杆菌的病例即可确诊。

采用ELISA检测患者血液内针对炭疽芽胞杆菌保护性抗原(PA)的抗体，方法参考WS283－2008《炭疽诊断标准》。

按Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒说明书进行标本核酸提取，特异性片段扩增按炭疽芽胞杆菌核酸荧光PCR检测试剂盒说明书进行，检测炭疽芽胞杆菌质粒PXO2上编码荚膜抗原基因(capA)、染色体上RNA聚合酶β亚单位编码基因(rpoB)、质粒PXO1上保护性抗原基因(pag)。

参考WS283－ 2008《炭疽诊断标准》，结合流行病学接触史和临床症状体征进行诊断。

此次皮肤炭疽暴发疫情共报告23例病例，病例分布在通辽市科尔沁区2个自然村，所有病例均与病牲畜宰杀、剥皮、贩运有关，无重症和死亡病例。采集到17例病例标本，病例标本采集时间距发病时间最短1 d，最长16 d，中位数为6 d。另6例病例因在外地(外省)就诊未采集到相关标本。15例可疑病例标本采集时均用过抗生素(15/17，88.24%)。

17例病例的病灶渗出物载玻片直接蘸取和涂抹物，渗出物载玻片蘸取后在实验室革兰染色，进行显微镜检查，结果仅有1份标本在显微镜观察到两端平齐的革兰阳性大杆菌(1/17，5.88%)。17例病例病灶渗出物标本均进行直接培养和增菌培养，分离出炭疽芽胞杆菌1株(1/17，5.88%)(表 1)。

表 1 2018年内蒙古通辽市23例炭疽病例及其检测结果 Table 1 he testing results of 23 anthrax patients in Tongliao, Inner Mongolia, China, 2018

表选项

ELISA方法检测15例病例的急性期血标本、17例病例的恢复期血标本和炭疽芽胞杆菌PA抗体，结果血清抗体阴转阳和抗体滴度4倍升高的病例共10例(10/15，66.67%)，有3份标本不属于急性期血清样本，按有效标本计算阳性率为83.33%(10/12)，见表 1。

用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit提取17例病例病灶涂抹物标本核酸，实时荧光定量PCR检测试剂盒扩增炭疽芽胞杆菌毒素质粒的pagA、染色体rpoB、荚膜质粒的capC基因，结果7例病例标本阳性(7/17，41.18%)，见表 1。

标本采集是细菌分离成功的前提条件和基本要求。未采集到合适的标本，错过采集标本的良好时机等情况均影响到后期标本检测工作，如从用过抗生素治疗的临床病例标本中基本分离不到细菌。笔者认为有以下3个方面可影响炭疽病例采集有效合格的标本:(1)皮肤炭疽主要经皮肤感染，感染局部皮肤初期发现小丘疹，24~48 h形成小水泡，为1~2 cm。水泡破裂形成溃疡，有黏性渗出液但无化脓，此时可以检出炭疽芽胞杆菌。但此时农牧民一般不去就诊治疗，错过最佳采样时间。(2)当1周后病灶部位形成焦痂，周围组织有大面积水肿，有痒无痛，典型的炭疽痈。常伴有淋巴结肿大，体温升高。这时患者感觉身体不适，自己服用抗生素类药物，2~3 d后不见好转才去最近村医诊所。一般情况下基层医务人员不按炭疽报告和采集标本。(3)受农牧区经济水平的限制和农牧民对炭疽的认知不足，农牧民发现患病动物不会立即向当地动物疫病控制机构报告。如果动物炭疽的监测足够敏感、防控措施到位，我们可以从动物疫情开始入手，主动搜索可疑患者，不仅可以在最佳时期采集标本也能控制传染源，能够最大限度地降低发病率同时控制可能造成的环境污染。此次疫情病例标本采集时间距发病时间最短1 d，最长16 d，中位数为6 d。早期发病的6例病例在外地(外省)就诊，导致未采集到相应的样本，直接影响病原体分离和疫情的早期定性。

根据梁旭东^[3] 1996年炭疽血清学监测资料分析，在炭疽疫区无病史人群采血1 688份，进行荚膜荧光抗体定性分析和ELISA检测PA抗体，结果暴发点人群荚膜荧光抗体阳性率为29.10%，非暴发点人群为7.52%。分析认为，疫区人群抗体水平升高，可能与隐性感染有关。薛采芳等^[4]报道，炭疽接触者(病人家属)ELISA检测PA抗体阳性率为50.00%~60.00%。显然单份血清无法诊断病例。根据我国的炭疽诊断标准，确诊炭疽必须要分离鉴定到炭疽芽胞杆菌或双份血清抗体滴度呈4倍升高^[5]。采集的15例病例急性期血清标本，其中有2例病例的抗体滴度已达到1:800和1:3 200，与后期采集的血清抗体滴度比较未达到4倍升高。17例病例恢复期血清标本中有14份检出PA抗体。说明炭疽监测工作中采集好炭疽病例血样本是提高病例诊断率的最好办法。但是由于采集双份血需要时间长，因此不利于用于暴发疫情中病例的早期诊断。

传统的细菌学和血清学检测中，都必须要有一定量的细菌和检测抗原。1985年PCR技术诞生后细菌学的分子诊断技术有了革命性变化，直接可以基因检测，可以检出1个菌体细胞或芽胞，也可以检测到1~10个DNA分子，从而大大提高了对目的物检出的特异性和敏感性^[6-7]。Okinaka等^[8]在炭疽芽胞杆菌质粒和染色体上设计引物对炭疽芽胞杆菌进行检测，实验证明，这些序列的扩增也可提供用于检测与鉴定炭疽芽胞杆菌的快速和可靠方法^[6-7]。此次疫情中从7例病例标本(7/17，41.18%)中检测出炭疽芽胞杆菌特异性核酸片段，该结果远高于细菌学检测阳性率(1/17，5.88%)，低于刘东立等^[9]报道的89.47%阳性率，可能与本次疫情标本采集时间和质量有关。PCR检测具有灵敏、特异、快速等优点，从标本中快速检测出炭疽芽胞杆菌核酸，有利于疫情早期定性，对病例的治疗和疫情控制争取时间甚至应对可能的恐怖袭击早期检测均非常重要，但目前我国现行的炭疽诊断标准中未将PCR检测作为病例诊断依据，笔者建议PCR检测应用于病例诊断依据。

综上所述，炭疽病例诊断无论用什么方法，我们的目的是早发现、早诊断、早治疗，尽早控制疫情。炭疽是一种流行因素明确的疾病，可被完全有效控制^[10]。为使炭疽疫情早确诊、早控制，在疫情早期发现、报告和第一时间采集有效标本是关键，并应用快速灵敏的诊断方法尽早确诊。