莱姆病是一种自然疫源性疾病，由伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)引起，经蜱叮咬传播，可导致游走性红斑、面神经麻痹、心脏病、关节炎等临床症状，严重者可致残疾甚至死亡，对人类危害严重^[1-2]。我国自1986年在黑龙江省海林县林区发现首例病例以来，在黑龙江、吉林、辽宁等29个省(直辖市、自治区)均有相关报道^[3]。在世界范围内，共发现20多种伯氏疏螺旋体基因型。而在我国，至少存在6种基因型，其中黑龙江、内蒙古、吉林省(自治区)等北方地区多以伽氏疏螺旋体(B.garinii)和阿弗西尼疏螺旋体(B.afzelii)为主，而浙江、贵州省、广西壮族自治区等南方地区则分布有法雷斯疏螺旋体(B.valaisiana)^[4-6]。小型啮齿类动物是莱姆病的主要宿主动物之一，病原体携带率高^[7]。因此，对鼠类伯氏疏螺旋体带菌情况的调查有利于预测和掌握莱姆病在当地发生的可能性，可为莱姆病防控工作提供参考。

福建省地处我国东南沿海，气候温和，且山高林密，海拔较低，适合鼠类等小型啮齿类动物生活繁衍。福建省于20世纪90年代初期曾有过莱姆病流行病学及病原学方面的相关报道，但在莱姆病分子生物学分型方面，尚处于空白，且福建省莱姆病相关研究资料年代较为久远，防控工作急需新的信息资料支撑^[8]。因此，本次对鼠类感染伯氏疏螺旋体的情况调查及分子生物学分型，旨在揭示该地区鼠类感染伯氏疏螺旋体的基因型差异，为有针对性地防治提供参考依据。

结合福建省鼠传疾病监测工作，选取邵武、长乐、古田、石狮、闽侯5个县(市)作为本次鼠类采集点。采用笼日法捕鼠，现场鉴定鼠种，并于无菌实验室内采集鼠肝、肾等组织，于-80 ℃冰箱保存。

组织标本经剪碎研磨成匀浆后，依照DNeasy Blood & Tissue Kit(购自QIAGEN公司)所述方法提取DNA，并于4 ℃条件下保存，备用。

根据参考文献[9]设计伯氏疏螺旋体5S-23S rRNA基因间隔区引物，Bb-out1：5′-CGA CCT TCT TCG CCT TAA AGC-3′；Bb-out2：5′-TAA GCT GAC TAA TAC TAA TTA CCC-3′；Bb-in1：5′-TCC TAG GCA TTC ACC ATA-3′；Bb-in2：5′-GAG TTC GCG GGA GA-3′(以上引物均由上海生物工程股份有限公司合成)。巢式PCR反应采用25 μl体系，其中，Premix Taq DNA聚合酶(购自TaKaRa公司)12.5 μl，模板3 μl，上、下游引物各0.4 μmol/L，用双蒸水补足至25 μl。第1轮PCR反应程序为95 ℃预变性5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃45 s，共40个循环，72 ℃延伸5 min；第2轮PCR反应程序为95 ℃预变性5 min，94 ℃45 s，59 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35个循环，72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像仪下观察结果。

将阳性标本送上海生工生物工程股份有限公司进行序列测定，通过BLAST和Clustal X1.8软件对测得的序列进行比对分析和剪切，MEGA 6.0软件采用邻接法(Neighbor- Joining，NJ)构建系统进化树，Bootstrap 1 000次。

应用SAS 10.3软件进行数据分析，两样本间率的比较采用Fisher’s确切概率法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

本次调查共捕获鼠类192只，其中家栖鼠81只，占捕获总数的42.19%，其中褐家鼠(Rattus norvegicus)78只，黄胸鼠(R.tanezumi)3只；野栖鼠111只，占57.91%，共计7个鼠种，其中以针毛鼠(Niviventer fulvescens)、黄毛鼠(R.losea)为优势鼠种，见表 1、2。

表 1 福建省5个县(市)鼠种分布

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表 2 福建省5个县(市)鼠类感染伯氏疏螺旋体情况

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如图 1所示，凝胶成像仪下核酸片段约为245 bp，与预期一致。本次共检出阳性标本4份，分别为东方田鼠1份(1/1)、黄毛鼠1份(1/46)、针毛鼠1份(1/38)和黄胸鼠1份(1/3)。81份家栖鼠标本中检出阳性标本1份，阳性率为1.23%；111份野栖鼠标本中检出阳性标本3份，阳性率为2.70%。家栖鼠与野栖鼠阳性率差异无统计学意义(Fisher’s确切概率法，P＝0.638)。

注：M.DL2000 Marker；GT38.为古田第38号标本；SS53.为石狮第53号标本；SW14.为邵武第14号标本；SW15.为邵武第15号标本 图 1 5S~23S rRNA基因间隔区琼脂糖电泳图谱

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通过BLAST和Clustal X1.8对4份阳性标本进行核酸序列比对。结果表明，邵武标本SW14与浙江省(EU160458.2)报道的法雷斯疏螺旋体在相应核苷酸序列上完全一致；石狮标本SS53与黑龙江省(JX888445.1)发现的法雷斯疏螺旋体在相应核苷酸序列上高度相似，仅在186位上缺失碱基G；提示SW14、SS53标本应为法雷斯疏螺旋体。邵武另1份阳性标本SW15与古田阳性标本GT38均与台湾省(HM100115.1)报道的法雷斯疏螺旋体在相应核苷酸序列上相似度最高，达到93%，存在部分碱基的置换和缺失。

对上述4份阳性标本序列及其相似度高的序列做进化关系分析，并选取我国常见基因型狭义伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体、阿弗西尼疏螺旋体和法雷斯疏螺旋体作为参照，采用NJ法构建进化树。结果如图 2所示，SW14、SS53分别与法雷斯疏螺旋体分离物R48(浙江，EU160458.2)、法雷斯疏螺旋体分离物11(黑龙江，JX888445.1)在同一分支，提示可能为相同基因型。SW15、GT38与法雷斯疏螺旋体KM19分离株(台湾，HM100115.1)和法雷斯疏螺旋体分离物R48(浙江，EU160458.2)处于不同的分支上，同时与狭义伯氏疏螺旋体(台湾，AY032903)、伽氏疏螺旋体(安徽，FJ790497)、阿弗西尼疏螺旋体(中国东北，FJ810217)均不在一簇内，显示了较大的基因差异。

图 2 伯氏疏螺旋体5S~23S rRNA间隔区片段的系统进化树

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莱姆病自20世纪80年代首次在我国发现以来，针对伯氏疏螺旋体的相关研究逐渐展开。近10年来，通过分子生物学手段对伯氏疏螺旋体进行检测和分析也逐渐成为新的研究方向。5S~23S rRNA基因间隔区是一段高变区，积累了丰富的型间差异，且其片段大小适中，已经成为伯氏疏螺旋体基因分型的常用手段^[10]。本次调查选用该片段作为巢式PCR的目的片段进行扩增，阳性产物片段符合预期设计。

在本次对福建省中部及西北部地区的调查中，所捕获的啮齿动物种类繁多，并从黄胸鼠、针毛鼠、黄毛鼠、东方田鼠检出伯氏疏螺旋体阳性，但总阳性率仅为2.08%，提示福建省伯氏疏螺旋体携带宿主多样，但带菌率较低，且家栖鼠与野栖鼠均存在感染，二者阳性率差异无统计学意义(P＝0.638)。家栖鼠携带莱姆病病原体在既往报道中较少提及，普遍认为野栖鼠是莱姆病病原体的主要宿主。受限于样本量稍显不足且检出阳性率低，后续将扩大样本量，以获得更可靠的实验数据。

对阳性标本进行系统进化分析结果可看出，本次在福建省西北及中部地区所发现的伯氏疏螺旋体与法雷斯疏螺旋体基因型序列一致或高度相似，与浙江、台湾省等周边省份所发现的伯氏疏螺旋体型别接近，表示法雷斯疏螺旋体可能是我国东南部地区主要型别之一。此外，标本SW15与GT38较为特殊，虽然与台湾省报道的法雷斯疏螺旋体分离株KM19处于同一簇内，但相互之间存在一定差异，提示福建省可能存在新的伯氏疏螺旋体基因型。因此，加强对莱姆病病原体的监测及基因分型，有助于发现新的型别，对莱姆病病原体及其遗传多样性的研究提供帮助。