淡色库蚊(Culex pipiens pallens)是我国北方常见的优势蚊种，其不仅骚扰人类工作和生活，还刺叮吸血、传播疾病，对人类健康造成严重威胁。目前，淡色库蚊防治以化学防治为主。化学杀虫剂的长期、大量、广泛使用，导致淡色库蚊抗药性日趋严峻，防控难度增大^[1-3]。吡丙醚，是一种环境友好、杀虫活性较高、靶标特异性强且不易产生抗性的昆虫生长调节剂，其可在较低浓度下有效抑制昆虫几丁质的合成，目前广泛用于农林业害虫及卫生害虫的防治^[4-5]。随着吡丙醚在卫生害虫防治中的大量使用，淡色库蚊、白纹伊蚊(Aedes albopictus)及家蝇(Musca domestica)逐渐对其产生了抗药性，大大降低了控制效果^[6-7]。

谷胱甘肽硫转移酶(glutathione s-transferases，GSTs)是昆虫体内三大解毒酶系之一，其对昆虫代谢内源和外源毒性化合物起着重要作用。据报道，GSTs在有机磷、有机氯、拟除虫菊酯类药剂的抗性形成过程中起重要作用^[8]，但GSTs是否参与昆虫生长调节剂抗性的形成尚无系统研究。笔者以室内筛选淡色库蚊抗吡丙醚种群为研究对象，通过比较分析淡色库蚊抗吡丙醚种群和敏感种群GSTs的生物化学性质，初步探讨淡色库蚊对吡丙醚的生物化学抗性机制，为其抗性治理提供参考依据。

淡色库蚊敏感种群，长期饲养于实验室，期间未接触任何杀虫剂；淡色库蚊抗吡丙醚种群，室内吡丙醚选育12代，抗性倍数达到5.69倍。

1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)、1，2-二氯-4-硝基苯(DCNB)、毒扁豆碱(eserine)以及考马斯亮蓝G250均购自Sigma公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠以及丙酮均为国产分析纯。冷冻离心机(BioRad公司)，紫外-可见分光光度仪UV-750(上海光学仪器公司)，电子天平Sartorius 2004MP(Opton公司)，恒温水浴锅(上海科技器材有限公司)。

挑选大小均一的3龄末4龄初淡色库蚊幼虫，称取一定体质量，4 ℃冰浴中加入磷酸缓冲液(0.04 mol/L，pH 7.0)匀浆，匀浆液在4 ℃、10 000×g离心20 min，取上清液备用。

GSTs比活力的测定方法参照Habig和Jacoby^[9]的方法并略加修改。分别以CDNB或DCNB为底物，采用0.9 ml反应体系。反应体系中依次加入0.03 ml谷胱甘肽(GSH)(终浓度1.0 mmol/L)、缓冲液、粗酶液，然后再加入0.03 ml CDNB或DCNB(终浓度1.0 mmol/L)，迅速混匀后，在340 nm(CDNB)或345 nm(DCNB)用时间驱动程序自动监测其吸光度(A)值在2 min内的变化，并记录反应速度。实验重复3次。

将底物CDNB及DCNB分别稀释成8~10个浓度梯度，测定GSTs在不同底物浓度下的比活力，并分别计算2种底物的米氏常数(Km)及最大反应速度(Vmax)。实验重复3次。

蛋白质含量测定方法参考Bradford考马斯亮蓝G250法并略加修改^[10]。用磷酸缓冲液将含有10~120 μg酶蛋白的溶液稀释至0.5 ml，然后加入2.5 ml考马斯亮蓝溶液，充分混和，静置2 min后，于595 nm测定A值，空白对照加等量的磷酸缓冲液。

采用Enzifit软件计算不同底物的Km和Vmax。样本均数的比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

GSTs活性底物不同，蚊虫种群GSTs的酶活性也不同。CDNB为底物时，抗性种群GSTs酶活性为3.626×10^-4 nmol/mg protein·min，敏感种群酶活性为2.737×10^-4 nmol/mg protein·min，二者间差异有统计学意义(t＝3.899，P＜0.05)；DCNB为底物时，抗性种群GSTs酶活性为10.260×10^-6 nmol/mg protein·min，敏感种群酶活性为6.982×10^-6 nmol/mg protein·min，二者间差异无统计学意义(t＝1.149，P＞0.05)(表 1)，表明GSTs在淡色库蚊吡丙醚抗性形成过程中可能起到解毒代谢作用。

表 1 淡色库蚊抗吡丙醚种群和敏感种群GSTs的酶活性 Table 1 GSTs activities of pyriproxyfen-resistant and susceptible populations of Culex pipiens pallens

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2种淡色库蚊种群GSTs对CDNB和DCNB的水解趋势类似，随着底物浓度的增加，其比活力逐渐升高，GSTs对CDNB的水解活性较高(图 1、2)，说明淡色库蚊GSTs的最适底物为CDNB。在一定浓度范围内，相同底物浓度下，抗性种群GSTs比活力略高于敏感种群(图 3、4)。

注：CDNB.1-氯-2，4-二硝基苯；DCNB.1，2-二氯-4-硝基苯 图 1 敏感种群GSTs对2种底物的水解趋势 Figure 1 Hydrolyzing tendency of GSTs from S strain to two substrates

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注：CDNB.1-氯-2，4-二硝基苯；DCNB.1，2-二氯-4-硝基苯 图 2 抗吡丙醚种群GSTs对2种底物的水解趋势 Figure 2 Hydrolyzing tendency of GSTs from R strain to two substrates

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注：CDNB.1-氯-2，4-二硝基苯 图 3 抗吡丙醚种群和敏感种群GSTs对CDNB的水解趋势 Figure 3 Hydrolyzing tendency of GSTs from two stains to CDNB

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注：DCNB.1，2-二氯-4-硝基苯 图 4 抗吡丙醚种群和敏感种群GSTs对DCNB的水解趋势 Figure 4 Hydrolyzing tendency of GSTs from two strains to DCNB

图选项

淡色库蚊抗吡丙醚种群GSTs对底物CDNB的Km和Vmax与敏感种群差异有统计学意义(t_a＝11.415，t_b＝6.411，P＜0.05)(表 2)，对底物DCNB的Km和Vmax与敏感种群比较差异无统计学意义(t_c＝0.134，t_d＝1.280，P＞0.05)，表明GSTs在吡丙醚抗性形成过程中可能起一定解毒代谢作用。

表 2 不同淡色库蚊种群GSTs对2种底物的酶动力学常数 Table 2 Enzyme kinetic parameters of GSTs to two substrates in the R and S populations of Culex pipiens pallens

表选项

昆虫生长调节剂，作为一类特异性杀虫剂，能阻碍或干扰昆虫个体的正常发育，降低昆虫个体的生活能力，进而导致昆虫死亡^[11-12]。因其具有环境友好、靶标特异性强及不易产生抗性的优点，逐渐成为昆虫综合治理的有效手段之一，也是当今开发和利用的重点。目前，以吡丙醚为代表的昆虫生长调节剂被广泛用于卫生害虫的防治，由于其具有不易产生抗性的优点，多年来鲜见有关卫生害虫对吡丙醚产生抗性的报道。由于昆虫对所有杀虫剂均存在产生抗性的风险，因此，近年来有关对吡丙醚产生抗性的蚊虫、家蝇逐渐被国内外报道^[13]。本研究以室内淡色库蚊种群为研究对象，通过逐代汰选的方式进行抗性选育，发现连续筛选12代，淡色库蚊对吡丙醚可达5.69倍的抗性，且对溴氰菊酯产生交互抗性^{[10, 14]}。由此得出，长期、连续、大量使用吡丙醚防治卫生害虫，会导致抗性产生；即使未使用吡丙醚，由于其能与其他药剂产生交互抗性，也会导致野外种群对吡丙醚产生抗性。

GSTs是昆虫体内的三大解毒酶系之一，主要以同源二聚体蛋白的形式存在于昆虫体内，根据等电点的不同可以将其分为两类：一类是酸性类，对CDNB有活性，而对DCNB活性很低或无活性；一类是碱性类，对DCNB和几种杀虫剂底物有活性^[8]。本研究结果表明，淡色库蚊GSTs对CDNB的活性远大于DCNB，且对DCNB的活性较低，表明淡色库蚊GSTs属于酸性GSTs。研究结果表明，相同底物浓度下，淡色库蚊抗吡丙醚种群GSTs酶活性略高于敏感种群，且2种种群Km和Vmax差异有统计学意义，表明GSTs可能参与淡色库蚊对吡丙醚的解毒代谢。

抗性的形成是多种因素综合作用的结果。了解抗性机制，对其抗性治理具有指导作用，但抗性机制的研究不仅要了解其在酶化学水平的差异，还应了解其基因表达量有无增加及基因有无突变，因此为进一步了解淡色库蚊对吡丙醚的抗性机制还需开展深入研究。