云南省地处我国西南部，属热带、亚热带气候，蚊虫种类丰富、分布广，是我国蚊类区系和物种分布的核心地带和关键地区，也是我国蚊媒传染病较多的省份之一^[1]。从蚊虫中分离的病毒包括5个病毒科11种病毒，如流行性乙型脑炎（乙脑）病毒（JEV）、登革热病毒（DENV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、辛德毕斯病毒（SINV）、版纳病毒（BNV）、云南环状病毒（YUOV）和巴泰病毒（BATV）等病毒^[2-4]。云南省与疟疾、登革热流行严重的缅甸、老挝、越南接壤，边境线长4 060 km，边境地区是云南省蚊传疾病的重要防控地区。如2015年以来，虽然疟疾大幅下降，但盈江等边境县（市）仍有周边国家边境地区的输入病例报告^[5]；自2013年以来在边境地区的德宏傣族景颇族自治州、临沧市和西双版纳傣族自治州（西双版纳州）多个县（市、区）均有因输入登革热病例引起的本地暴发疫情报告^[6-8]。为进一步了解云南省边境地区蚊虫种类及其携带病原体状况，2013-2015年在孟连傣族拉祜族佤族自治县（孟连县）、勐海县和江城哈尼族彝族自治县（江城县）3个边境县开展了相关调查。

根据云南省边境口岸分布以及疟疾、乙脑和登革热等虫媒疾病的流行情况，选择与缅甸相邻的普洱市孟连县、西双版纳州勐海县以及与老挝相邻的江城县为调查点。其中，孟连县属南亚热带湿润气候，年平均气温19.6 ℃，年平均降雨量1 373 mm；江城县属亚热带湿润气候，平均气温19.6 ℃，年平均降雨量1 662.9 mm；勐海县属热带、亚热带西南季风气候，年平均气温18.7 ℃，年平均降雨量1 341 mm，该3县适合蚊虫孳生繁衍。

（1）人工诱捕法：2013-2015年6-10月，在孟连、勐海和江城县依据《登革热防治手册》^[9]所述方法在居民区附近竹林或林区诱捕成蚊，于16：00-18：00蚊虫活动高峰时采集，每月1次，每次5~7 d，成蚊密度单位为只/（人·h）。（2）诱蚊灯通宵捕蚊法：按照《全国病媒生物监测方案（试行）》^[10]，在调查点内选择人房、畜房布放诱蚊灯（“功夫小帅”UV光催化捕蚊器，220 V，50 Hz，24 W，武汉吉星环保科技有限责任公司生产），20：00至次日08：00布放，每个调查点6-10月每月监测1次，每次连续5 d，成蚊密度单位为只/（灯·夜）。将捕获蚊虫置于-20 ℃冰箱中冷冻20~40 min，在解剖镜下进行蚊虫形态学鉴定、计数，按不同蚊种放置于冻存管，液氮保存^[11]。

（1）虫媒病毒检测与鉴定：采用冯云等^[12]方法分离病毒并提取病毒RNA〔天根生化科技（北京）有限公司，DNA/RNA共提取试剂盒，批号：03330〕，将RNA反转录为cDNA〔天根生化科技（北京）有限公司cDNA第一链合成试剂盒，批号KR103〕，再用RT-hemi-nested PCR扩增病毒核酸。（2）半巢式多重PCR法检测疟原虫和丝虫：参考周正斌^[13]实验方法检测蚊虫携带疟原虫子孢子和丝虫情况。

用Clustal X1.83软件进行碱基配对后在MEGA 5.0软件用Neighbor-Joining方法完成病毒进化树的构建，模型采用Kimura2- parameter model，Bootstrap值设定为1 000。

共捕获蚊虫10属39种126 893只。其中，三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）104 476只（82.33%）、中华按蚊（Anopheles sinensis）18 422只（14.52%）、白纹伊蚊（Aedes albopictus）1 212只（0.96%）、致倦库蚊（Cx. pipiens quinquefasciatus）891只（0.70%），其他蚊虫1 892只（1.49%）；诱蚊灯通宵诱捕法捕获的优势蚊种为三带喙库蚊和中华按蚊，人工诱捕法优势蚊种为白纹伊蚊和骚扰阿蚊（Armigeres subalbatus）（表 1）。

表 1 云南省孟连、勐海和江城县蚊虫种类组成 Table 1 Composition of mosquito species in Menglian, Menghai, and Jiangcheng county in Yunnan province

表选项

302批样本均未发现疟原虫和丝虫扩增片段，其中2批三带喙库蚊标本中检出JEV。

将2株JEV的测序结果用DNASTAR 7.1软件进行同源性分析。于基因库中选出12株JEV的NS5基因序列，ML22和ML24 NS5基因的相似性为97%，其中ML22与基因Ⅰ~Ⅳ型标准株间的相似度分别为97%、91%、89%和89%，为ML22和ML24均属基因Ⅰ型提供依据。系统进化树分析发现，参考病毒株分别分布于相应的基因型拓扑结构群中，2株新检测到的JEV与其他3株基因Ⅰ型JEV参考株处在同一进化簇中，但2株JEV核酸之间仍存在一定差异，ML24与SCYA201201-86在同一分支上，而ML22则单独形成一支（图 1）。

注：▲为本次云南分离株 图 1 云南省流行性乙型脑炎病毒基于JEVns5基因区段的系统进化分析 Figure 1 A phylogenetic analysis of Japanese cephalitis virus based on JEVns5 gene segment

图选项

本次调查3个县蚊虫种类组成虽然不同，但三带喙库蚊和中华按蚊是夜间活动的主要优势蚊种，白纹伊蚊属白天活动的优势蚊种。与王剑等^[14]2012-2015年和王丕玉等^[15]2003-2008年在中国和缅甸以及中国和老挝边境地区夜间蚊虫种类组成调查结果基本一致。对于白天活动优势蚊种，本次调查结果与王丕玉等^[15]和张海林等^[16-17]结果基本相似，可能与近年经济发展，农业结构由原来的广泛种植水稻转变为种植茶叶、橡胶及香蕉等热带作物，蚊虫孳生地改变有关；同时也可能与蚊虫对杀虫剂抗药性的影响有关，如三带喙库蚊、中华按蚊及白纹伊蚊在上述地区均存在抗药性，这些蚊种一直是当地的优势蚊种^[18-20]。

中华按蚊是丝虫病和疟疾的重要传播媒介^[21]，在云南省分布广泛，本次也收集到大量中华按蚊，但未检测到疟原虫和丝虫核酸。

JEV分为5个基因型^[22]，JEV基因Ⅰ型在1979年左右传入中国^[23]，2009年首次在西藏自治区分离到JEV基因Ⅴ型^[24]。云南省是中国乙脑的高流行区之一^[25]，20世纪70-90年代流行JEVⅢ型^[26]；2002- 2006年云南省西北部地区流行JEVⅠ型，中南部流行JEV基因Ⅲ型^[27]。本次调查获得2株JEV，通过BLAST比对和进化分析，均为JEV基因Ⅰ型；此毒株与2009年中国疾病预防控制中心及2012年四川农业大学分离株同源，为我国广泛流行的乙脑毒株。本次调查结果提示，云南省边境地区蚊虫乙脑自然感染的风险高，建议应加强疫苗接种工作。