蚊媒病毒是指通过蚊虫叮咬敏感的脊椎动物（如人、马、猪等）而传播疾病的一类病毒，是虫媒病毒的重要组成部分。目前已知与人类疾病密切相关的蚊媒病毒有黄病毒属（Flavivirus）、甲病毒属（Alphavirus）和布尼亚病毒属（Bunyavirus）等，主要引起流行性乙型脑炎（乙脑）、登革热、西尼罗热、基孔肯雅热等^[1-2]。有些蚊媒病如乙脑、登革热等多次引起世界大流行，严重危害人类健康^[3-4]。

贵州省位于我国西南部，地处低纬度山区，地势高差悬殊，属于亚热带高原季风湿润气候，年平均气温15 ℃，年平均降雨量1 200 mm，相对湿度78%~84%，其复杂的自然环境和多样的气候特点适合蚊虫孳生及蚊媒病毒的传播^[5]。贵州省是我国乙脑的高发省份，自1978年以来乙脑发病持续高于全国发病水平^[6-7]。近年来，在贵州省的蚊媒病毒调查中分离到多株乙脑病毒（JEV）和盖塔病毒^{[5, 8]}；对贵州省虫媒病毒人群血清流行病学调查时发现，在检测的502份血清标本中，除检测到JEV外，还检测到甲病毒抗体，其中JEV抗体阳性检出率最高，为12.15%^[9]；而在贵州省健康人群血清标本中检测到登革热病毒IgG和IgM抗体，且分布较为广泛^[10-12]；2016年在贵州省德江县蚊媒病毒调查中还分离到寨卡病毒^[13-14]，是我国首次在蚊虫标本中检测到该病毒。基于以上研究现状，为了更好地了解贵州省蚊虫及蚊媒病毒的流行情况，本研究对贵州省不同地区开展蚊虫调查和病毒分离，明确当地存在的蚊虫和蚊媒病毒种类，为蚊媒病的预防和控制提供科学依据。

2018年8月在贵州省黎平、从江县、花溪、乌当区4个采集点采集蚊虫。每个采集点于每晚20：00至次日08：00使用紫外诱蚊灯法在猪圈、牛圈、羊圈等牲畜棚进行蚊虫采集。将收集的蚊虫标本于-20℃速冻处理，快速进行蚊虫种类的鉴定，鉴定过程中蚊虫下方放置冰块，确保低温。鉴定完毕将蚊虫按不同地点不同种类分别计数编号，分装至冻存管，每管50只，完成所有分装后置于液氮罐保存并将蚊虫标本运输至中国疾病预防控制中心传染病预防控制所媒介生物控制室备用。

使用Rneasy MiNi Kit（QIAGEN，Germany公司）根据操作说明提取病毒RNA，得到的RNA于-40 ℃保存备用。使用QuantiNova^TM Reverse Transcription Kit（QIAGEN，Germany公司）制备cDNA。鉴定病毒使用的属特异性引物（黄病毒属、甲病毒属）和种特异性引物（JEV、登革热Ⅰ~Ⅳ型病毒、黄热病病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒、辛德毕斯病毒、基孔肯雅病毒、盖塔病毒）来自文献[14-16]，引物序列、扩增片段等引物信息见表 1。

表 1 鉴定病毒使用的属及种特异性引物信息 Table 1 Detailed background of the primers used for virus identification in the study

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PCR扩增体系为25 μl，包括Go Taq^R Green Master Mix，2×（Promega）12.5 μl、cDNA模板1 μl、10 μmol/L的正、反向引物各1 μl、ddH₂O 9.5 μl。PCR反应结束后，取PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察有无目的条带，有目的条带的PCR产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序。将从测序公司获得的序列在美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站的GenBank上进行BLAST分析，确定病毒基因的种类。

采用MEGA 6.0软件邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建NJ进化树对JEV基因核苷酸序列进行系统进化分析，bootstrap值设定为1 000。在GenBank上下载不同国家、不同时间、不同宿主、不同基因型的62株JEV E基因核苷酸序列，其中基因1型23株，基因2型5株，基因3型30株，基因4型2株，基因5型2株，外群病毒为墨累谷脑炎病毒（OR156）1株。

2018年在贵州省4个采集点共采集蚊虫3属4种17 018只，包括三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）、淡色库蚊（Cx. pipiens pallens）、中华按蚊（Anopheles sinensis）和骚扰阿蚊（Armigeres subalbatus），其中骚扰阿蚊数量最多，占采集蚊虫总数的39.0%。其中黎平县和乌当区的优势蚊种为骚扰阿蚊，分别占48.0%和53.2%；从江县和花溪区的优势蚊种为三带喙库蚊，分别占34.2%和84.9%，见表 2。

表 2 2018年贵州省不同地区蚊种分布数量及构成 Table 2 Numbers and composition of mosquito samples in different regions of Guizhou province in 2018

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采集的蚊虫共研磨处理96批，对研磨的上清液提取核酸并进行多种属和种特异性引物的病毒基因扩增及测序，结果显示编号为GZWK、GZWA在黄病毒属特异PCR引物以及JEV特异PCR引物扩增为阳性，经序列测定及BLAST比对分析显示GZWK、GZWA分别为基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV。

经序列测定与比对，贵州省新分离JEV株的E基因核苷酸序列长度为1 500 bp，位于病毒基因组第983~2 482位。将新分离株GZWK、GZWA与从GenBank上下载的不同国家、不同时间、不同宿主、不同基因型的62株JEV以及OR156病毒株构建E基因的系统进化树。结果显示，GZWK与基因Ⅰ型JEV同为一个进化分支，GZWA与基因Ⅲ型JEV同为一个进化分支，GZWK、GZWA与基因Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ型JEV的进化关系稍远，与外群病毒OR156差异较大。经核苷酸比对及进化分析显示，GZWK与基因Ⅰ型JEV VN105越南分离株进化关系较近，同源性最高，核苷酸同源性为99%，氨基酸同源性为100%；GZWA与基因Ⅲ型JEV FJ0339福建省分离株进化关系较近，同源性最高，核苷酸同源性为99%，氨基酸同源性为100%，见图 1。

注：▲为本研究中分离到的JEV 图 1 基于乙脑病毒的E基因核苷酸序列为基础的系统进化分析 Figure 1 Phylogenetic analysis based on the nucleotide sequence of E gene of Japanese encephalitis virus

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贵州省气候温和，雨量充沛，地貌类型复杂多样，非常适宜蚊虫的生长繁殖。贵州省的蚊虫种类共有7属70多种，主要有中华按蚊、三带喙库蚊、淡色库蚊、白纹伊蚊（Aedes albopictus）、骚扰阿蚊等^[17]。本研究共采集蚊虫3属4种17 018只，以骚扰阿蚊和三带喙库蚊数量较多，为当地的优势蚊种。李铭华等^[8]2008年在贵州省不同地区共采集蚊虫3属4种，以骚扰阿蚊为优势蚊种；宋颂等^[5]2016-2017年在贵州省采集蚊虫3属4种，以中华按蚊和骚扰阿蚊为优势蚊种，上述研究结果与本研究结果基本一致。

乙脑是一种严重的虫媒病毒性疾病，病死率高达5%~35%，严重威胁人类健康^[18-19]。在世界范围内，乙脑主要流行于亚洲地区，中国是乙脑的主要流行区^[20]。贵州省是我国乙脑的高发省份，对贵州省2011-2015年乙脑流行特征分析显示，乙脑病例高度散发，主要集中在西部及西南部地区，发病高峰集中在7-9月^[6]。近年来，在贵州省不同地区对虫媒病毒进行调查，分离到JEV、盖塔病毒、版纳病毒、寨卡病毒等多种蚊媒病毒，其中版纳病毒和寨卡病毒均为贵州省首次检测到，表明贵州省虫媒病毒存在多样性^{[5, 8]}。本研究对贵州省4个地区采集的蚊虫标本进行病毒检测，共检测到2株病毒。通过序列及系统进化分析，证实2株病毒分别为基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV，未发现其他病毒。尽管本研究未分离到其他蚊媒病毒，但由于贵州省具有非常适宜蚊虫孳生的地理环境及自然条件，因此还应继续进行相关蚊媒病毒调查的系统研究，为当地乙脑及其他蚊媒病的预防和控制提供预警和依据。