登革热病毒属于黄病毒科黄病毒属，可分为登革1~4四个血清型，其中2型传播最广泛。登革热病毒可以引起登革热、登革出血热和登革休克综合征，死亡率高达10%，严重危害人类健康^[1]。登革热具有传播迅猛、发病率高、人群普遍易感、重症类型死亡率高等特点，被认为是全球最受关注的传染病^[2]。据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年约1亿人感染登革热，主要分布于热带与亚热带地区^[3]。我国自20世纪80年代以来，登革热几乎每年都会在广东、广西、海南、浙江等地发生不同程度的流行，而输入性病例在我国多数省份均有分布^[4]。近年来，随着全球气候变暖、国内外人口流动频繁及蚊虫防控措施不当等，登革热发生区域不断扩大，发病率不断升高^[5]。因此，了解登革热病毒的分子生物学特征，做好登革热病毒的检测和防控工作十分重要。

1 登革热病毒的分子生物学特性 1.1 基因组结构与功能

登革热病毒为单股正链RNA病毒，基因组全长约11 000 bp，病毒基因组由5′端非编码区（5′-NCR）、结构蛋白编码区、非结构蛋白编码区和3′端非编码区（3′-NCR）组成^[6]。基因组只有1个开放读码框，其5′端编码3个结构蛋白（C蛋白、M蛋白和E蛋白），3′端编码7个非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）。从5′端至3′端的基因排列顺序为5′-C-PrM-E-NS1-NS2A- NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3′。其中5′端具有I型帽子结构m7G5’ppp5’Amp，其功能是保护RNA 5′端免受核酸酶或磷酸酶的降解，并促进起始翻译。3′端缺乏poly（A）尾结构，在黄病毒中高度保守，可能在基因组复制中发挥作用。

1.2 蛋白质功能

登革热病毒基因组编码区为单一可读框，可翻译出含3种结构蛋白与7种非结构蛋白的聚蛋白前体，然后经蛋白水解酶切割，产生单个的结构蛋白和非结构蛋白。

结构蛋白主要参与病毒对宿主细胞的吸附及病毒颗粒的组装，是形成病毒粒子形态结构的主要物质成分，包括C蛋白、M蛋白和E蛋白。C蛋白即为病毒的衣壳蛋白，由110~127个氨基酸残基组成，富含精氨酸和赖氨酸，具有特异的抗原决定簇，一般不诱导机体产生中和抗体。C蛋白除参与病毒颗粒的组装与复制，保护病毒基因组稳定性外，还可通过调节炎症细胞因子诱发细胞凋亡^[7]。M蛋白是包膜蛋白，在包膜与质膜融合方面起重要作用，只有含M蛋白的成熟病毒颗粒才能介导E蛋白与细胞膜的融合。E蛋白是登革热病毒最主要的结构蛋白，主要参与病毒与细胞受体的结合和病毒包膜与细胞膜的融合，还可以直接暴露于宿主的免疫系统而诱发产生中和抗体^[8]。E蛋白是病毒的主要毒力蛋白也是主要的抗原蛋白。根据不同抗原性可将登革热病毒分为登革热1~4四种血清型。E蛋白因其在病毒感染细胞早期的吸附与膜融合以及感染晚期病毒颗粒的组装与释放过程中起关键作用而成为人们研究的重点，对其结构与功能的进一步了解将为新型疫苗和特异抗病毒药物等的研制提供重要的理论基础。

非结构蛋白主要在病毒基因组的复制和翻译过程中发挥重要作用，包括NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。NS1蛋白可以诱发机体产生自身免疫病理作用，还可以作为辅助因子参与病毒基因组的复制^[9]。NS2A蛋白可能参与病毒基因组的复制，也可能具有调控干扰素通路的作用。NS2B蛋白是NS3蛋白N端丝氨酸蛋白酶的激活剂，要与NS3蛋白共同组成复合体来发挥蛋白水解酶活性^[10]。NS3蛋白具有丝氨酸蛋白酶活性、三磷酸酶活性和RNA解旋酶活性，并且参与病毒基因组的复制^[11]。NS4A和NS4B蛋白均为疏水性蛋白，前者可能在基因组复制中起调节作用，后者可能以促进NS3蛋白沿RNA链移动的方式来协助双链RNA解旋^[12]。NS5蛋白是登革热病毒编码的最大蛋白质，具有甲基转移酶（methyltransferase，MTase）活性和依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）活性，MTase参与了病毒基因组5′端帽子结构的形成，RdRp参与了基因组RNA的复制^[13]。NS5蛋白除参与病毒基因组复制外，还与病毒的致病密切相关^[14]。

2 登革热病毒的检测方法 2.1 病毒分离培养法

病毒分离培养法是检测登革热病毒的金标准，主要包括乳鼠脑内接种法、细胞培养法和蚊虫接种法。

2.1.1 乳鼠脑内接种法

乳鼠脑内接种法在登革热病毒的检测中早已应用，但有些病毒嗜神经性不高，分离阳性率低，现已极少使用。

2.1.2 细胞培养法

常用的敏感细胞包括白纹伊蚊（Aedes albopictus）细胞（C6/36）、巨蚊细胞（TRA-284/184/171/671）、伪盾伊蚊细胞（AP-61）、恒河猴肾传代细胞（LLC-MK2）、地鼠肾细胞（BHK-21）、非洲绿猴肾细胞（Vero）等，其中以C6/36细胞对登革热病毒最为敏感，巨蚊细胞次之。细胞培养法的灵敏度不高且对不能引起细胞病变的病毒株不能通过此方法检出。

2.1.3 蚊虫接种法

埃及伊蚊（Ae. aegypti）、白纹伊蚊和巨蚊是分离登革热病毒的敏感蚊种，常采用成蚊胸腔接种法和幼蚊脑内接种法。成蚊胸腔内接种是目前最为敏感的登革热病毒分离方法，4种血清型登革热病毒的分离率高达84.2%^[15]。蚊虫接种法比乳鼠脑内接种法和细胞培养法更敏感，但不适宜病毒的快速分离。

病毒分离一般需要几天到数周的时间，有时可能需要盲传几代才可分离到病毒，因此耗时长，不能用于疾病的早期诊断，在进行病毒检测时一般不单独使用，常与其他方法结合。

2.2 血清学检测方法

血清学方法是比较经典的病毒检测方法，主要用于检测标本中病毒特异抗体或抗原，在病毒感染的诊断与病毒分离鉴定中必不可少。传统的血清学方法包括血凝抑制试验、补体结合试验、中和试验等。随着相关技术的发展，现代免疫技术如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光技术（IFA）、酶免疫测定法、胶体金免疫层析技术、斑点印记法等也应用于病毒的检测。

2.2.1 血凝抑制试验

该方法不需要特殊的仪器设备，简便快速且适用于大规模人群的抗体筛查和血清流行病学调查。目前，该方法仍然是WHO推荐的作为登革热病毒血清学分型的标准方法。血凝抑制敏感性较高，可检测低至1 μg/ml的抗体，但血凝抑制试验也存在一些缺点：①缺乏特异性，不能将登革热病毒与其他黄病毒如日本脑炎病毒、西尼罗病毒等区分开；②需预先用高岭土处理，以去除非特异性抑制物；③易发生交叉反应且不能区分登革热病毒的血清型；④登革热病毒血凝活性测定对pH值要求十分严格，试验前均需测定最适pH值^[16]。

2.2.2 补体结合试验

登革热病毒的补体结合抗体出现较晚，在发病后7~14 d，一般晚于IgM或血凝抑制抗体，并且持续时间短。这种方法敏感性和特异性较差，操作复杂，故此法现在很少用于登革热病毒的实验室检测^[17]。

2.2.3 中和试验

中和试验主要用于检测待检标本中的病毒特异性中和抗体水平，也是登革热病毒分离鉴定及疫苗效果评价中不可缺少的较为准确的方法。中和试验包括小鼠中和试验、组织培养中和试验及蚀斑减少中和试验，以蚀斑减少中和试验应用较广。该方法敏感性和特异性较血凝抑制试验和补体结合试验高，但中和试验潜在的问题是血清中存在血清因子的非特异性抑制。另外，该方法需使用活病毒，技术操作复杂、费时，一般不用于病毒诊断^[18]。

2.2.4 酶联免疫吸附试验

利用ELISA法可在患者组织和细胞标本中检测到病毒抗原。常用的ELISA法有荧光ELISA、间接ELISA和IgM/IgG捕获ELISA法。荧光ELISA主要用于血清标本中登革热抗原的检测。与病毒分离法比较，荧光ELISA的敏感性及特异性分别为90.0%和99.0%。该方法的缺点是需要使用高亲和力和高特异性的登革热病毒单克隆抗体。间接ELISA和IgM/IgG捕获ELISA法主要用于登革热病毒特异抗体的检测。Thiha和Ibrahim^[19]对64例登革热住院患者进行登革热抗体IgG ELISA检测，结果表明该方法具有高灵敏度，敏感性及特异性分别为95.0%和100%。

2.2.5 免疫荧光技术

IFA是一种快速检测登革热病毒的方法，不仅可用于细胞内病毒抗原的检测，还可用于病毒特异抗体的检测。IFA包括直接IFA和间接IFA，登革热病毒感染的诊断多采用间接IFA。方法如下：先将登革热病毒感染的敏感细胞（如C6/36细胞）制备成抗原片，固定后加入待检患者血清，最后加入标记的第二抗体（羊抗人IgG）反应后即可在荧光显微镜下观察结果。患者的急性期和恢复期双份血清标本中抗体滴度出现≥4倍升高时即可确诊^[20]。

2.3 核酸检测方法

与传统的病毒分离法和血清学检测方法相比，核酸检测技术在登革热病毒早期检测方面具有独特的优势，主要包括PCR技术、核酸杂交技术、基因芯片技术、序列测定法及生物传感器等方法。

2.3.1 PCR技术 2.3.1.1 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）

RT-PCR能够快速检测登革热病毒。为提高RT-PCR的灵敏度和特异性，许多学者将PCR反应条件做了简化，如从多对引物到1对通用引物、多管反应到1管反应等^[21]。Waggoner等^[22]采用1对通用引物从血清样品中扩增出登革热病毒，RT-PCR检出率为97.0%，敏感性及特异性分别为91.4%和95.4%。

2.3.1.2 巢式PCR

巢式PCR（nested RT-PCR）采用2对引物通过2轮PCR反应进行扩增，敏感性高、特异性强，方法简便快速，为登革热病毒的检测提供有效手段。Lanciotti等^[23]采用巢式PCR对登革热病毒进行了检测及分型，与病毒分离法相比，巢式PCR检测登革热病毒1~4型的敏感性分别为94.0%、93.0%、100%和100%。

2.3.1.3 多重PCR

多重PCR（multiplex PCR）是在同一反应体系中加入多对特异性引物，一次扩增多个靶片段从而实现多种病原体的同时快速检测。Waggoner等^[24]采用多重PCR技术检测登革热病毒1~4型，敏感性为98.0%，特异性为100%。多重PCR可以在一个反应体系中同时对登革热病毒1~4型进行检测与分型，简化了操作步骤，大大节省了时间和试剂，但多重PCR体系中引物设计难度大，容易导致实验失败和假阳性结果。

2.3.1.4 实时定量PCR

实时定量PCR（Quantitative real- time PCR，qPCR）是在常规PCR基础上运用荧光定量传递技术，借助荧光信号来检测PCR产物。Ahmed和Broor^[25]采用qPCR监测登革热病毒，特异性及敏感性分别为100%和79.4%。Simmons等^[26]采用多重实时荧光定量PCR检测登革热病毒，敏感性为95%，特异性为100%。与RT-PCR相比，qPCR具有敏感性及特异性高、简便快速并可进行绝对定量等优势。常用的荧光标记探针为SYBR Green和TaqMan探针。

2.3.1.5 核酸序列等温扩增法（NASBA）

NASBA法是通过cDNA中间体在等温条件下进行序列特异性核酸体外扩增。Wu等^[27]建立了检测登革热病毒RNA的NASBA法，扩增出1~4型登革热病毒。NASBA法的敏感性及特异性高于病毒分离培养法和ELISA法，但此法操作复杂且需要昂贵的仪器设备。

2.3.2 核酸杂交技术

庄坚等^[28]利用标有地高辛的cDNA探针，用斑点杂交法检测登革热2型病毒RNA，结果呈强阳性。尽管核酸杂交法具有特异性强、敏感度高等优点，但此法对登革热感染仅具有早期诊断意义，而且技术要求高、费时费力等，因此不适合常规采用。

2.3.3 基因芯片技术

近年来发展起来的基因芯片技术在病毒检测方面具有独特优势，成为国内外研究的热点。基因芯片技术具有高通量的特点，可以对病原体进行综合检测和分析。与传统的检测方法相比，基因芯片技术可用同一张芯片同时对大量样品进行检测，能特异地检测出登革热病毒并快速分型，具有敏感性高、特异性强的特点。但基因芯片技术目前尚处于起步阶段，各项技术参数有待进一步改进和完善，短时间内推广普及有一定难度。因而研发一种价格低廉、易于推广的基因芯片将成为登革热病毒快速检测的理想手段。

3 展望

登革热是一种急性虫媒传染病，对人类的健康产生极大的威胁，随着现代分子生物学技术的发展，对登革热病毒分子生物学特征的了解也更加深入，这对于登革热病毒新型疫苗和特异抗病毒药物的研制提供了理论基础。一些新的分子生物学技术如qPCR、NASBA、基因芯片及生物传感器等的推广和使用，会使病毒的检测工作实现快速、准确、灵敏、特异和高通量，大大提高检测速度和检出率。