蝇类是一类常见的医学媒介生物，夏秋季节繁殖旺盛，主要在垃圾堆、食堂、厨房、起居室等区域活动，与人类的生活密切相关。有文献报道，蝇类携带多种细菌、病毒、寄生虫卵等^[1-2]，取食频繁，其粪便可污染食物，其习性在蝇类机械性传播疾病方面具有重要意义^[3]。随着我国对外开放和国际贸易的增加，人口流动和出入境需求日益增多，蝇类可以通过交通工具及行李物品实现短时间内跨地区甚至跨国转移，增加了疾病传播的风险。为此，我们于2017年5-10月在西藏口岸地区对蝇类携带病原体进行了检测，现将结果报告如下。

于2017年5-10月在西藏自治区拉萨贡嘎国际机场口岸、吉隆口岸、亚东口岸采集蝇类样本。

GN增菌液、7.5%氯化钠肉汤、碱性蛋白胨水、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、肠道增菌肉汤、乙酰胺琼脂平板、TCBS琼脂平板、SS琼脂平板、Baird-Parker平板、肠球菌琼脂平板、营养琼脂粉等购自北京陆桥技术股份有限公司。微生物鉴定卡购自生物梅里埃中国有限公司。分子试剂购于Thermo Fisher scientific公司。细菌目标片段基因测序委托北京擎科新业生物技术有限公司进行。

甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、柯萨奇病毒（A16型）、肠道病毒（通用型）、轮状病毒（A型）采用RT-PCR检测方法，核酸检测试剂盒购于中山大学达安基因股份有限公司和上海之江生物科技股份有限公司，核酸提取试剂为西安天隆科技有限公司提供的DNA/RNA共提取试剂盒。

蝇类样本分类鉴定后进行适当分组（每组1~20只）。将分组后的样本置于灭菌离心管中，加入5颗灭菌氧化锆珠，适量（500~1 000 μl）灭菌生理盐水，研磨匀浆。吸取适量匀浆液（100~200 μl），接种到5 ml GN增菌液、碱性蛋白胨水、7.5%氯化钠肉汤、亚硒酸盐胱氨酸增菌液及肠道增菌肉汤中，于37 ℃摇床中振荡8~24 h（视不同增菌培养基而定），进行增菌培养。根据细菌培养物浑浊程度对增菌液进行适当稀释，取10 μl稀释液均匀涂布到相应的SS琼脂平板、乙酰胺琼脂平板、TCBS琼脂平板、甘露醇卵黄多粘菌素琼脂基础平板、山梨醇麦康凯琼脂平板上，置于培养箱中37 ℃培养17~20 h。挑取不同形态、不同大小的单菌落分别接种于营养琼脂平板进行分离纯培养，直至得到纯菌为止。

以纯化的菌体基因组DNA为模板，PCR扩增16S rRNA基因，通用引物为正向引物27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；反向引物1490R：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。目标基因片段约1 500 bp。用灭菌枪头挑取纯菌溶于10 μl DEPC H₂O，99℃ 10 min，获得目标菌群核酸产物。反应体系（50 μl）为：Thermo Master mix 25 μl，27F 1 μl，1490R 1 μl，ddH₂O 20 μl，DNA 3 μl混合，反应条件为95 ℃变性1 min；95 ℃30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，35个循环；72 ℃10 min，冷却至4℃。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，对条带清晰的产物送北京擎科新业技术有限公司测序，获得序列与美国国立生物技术信息中心（NCBI）已知数据库进行BLAST比对（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/），数据库选择16S ribosomal RNA sequences（Bacteria and Archaea）。取相似度（≥98%）最高的作为鉴定结果。

对于细菌基因鉴定不能获取确切结果的种类进行细菌生理生化鉴定：用灭菌棉签（接种环）沾取（挑取）新鲜纯菌落，置于事先准备好的比浊管（含0.45%盐水3 ml）中，直到浊度达0.5~0.6麦氏单位。将预先平衡到室温的细菌鉴定卡放入与比浊管对应的载卡架上，将载卡架移入到全自动微生物鉴定系统中，进行细菌生理生化鉴定。

将蝇类样本按照鉴定的结果分类，根据样本数量随机抽取乌拉尔丽蝇（Calliphora uralensis）、新陆原伏蝇（Protophormia terraenovae）、丝光绿蝇（Lucilia sericata）、巨尾阿丽蝇（Aldrichina grahami）、厩腐蝇（Muscina stabulans）和家蝇（Musca domestica），每种5~10只，加入PBS溶液研碎，共50份样本。

使用西安天隆科技有限公司提供的DNA/RNA共提取试剂盒提取核酸，按照说明书操作。

使用中山大学达安基因股份有限公司提供的相应病毒检测RT-PCR试剂盒进行检测，按说明书进行操作。阳性样本使用上海之江生物科技股份有限公司试剂盒进行复核。

检测蝇类样本100份，包括4科19属30种。共检出细菌37种。乌拉尔丽蝇、新陆原伏蝇、丝光绿蝇和巨尾阿丽蝇携带细菌种类最多，分别为15、13、13和12种。其中革兰阳性菌中粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、耐久肠球菌（E. durans）、漫游球菌属（Vagococcus sp.）是感染较多的细菌，革兰阴性菌中大肠埃希菌（Escherichia coli）、蜂房哈夫尼亚菌（Hafnia alvei）、威斯康星米勒菌（Moellerella wisconsensis）等是感染较多的细菌，这些细菌均为条件致病菌，见表 1。

表 1 西藏口岸不同蝇类携带细菌情况

表选项

对西藏口岸捕获的蝇类检测甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、柯萨奇病毒（A16型）、肠道病毒（通用型）和轮状病毒（A型），检出1例轮状病毒阳性，检出率为2.0%（1/50），携带病毒的蝇种为新陆原伏蝇，见表 2。

表 2 西藏口岸不同蝇类携带病毒情况

表选项

蝇类在自然界中分布广泛，也是国境口岸重点监测病媒生物中的一个重要种类，因其生活习性，极易污染食物和水源，对居民健康造成威胁。通过对西藏口岸捕获蝇类进行细菌、病毒等检测，基本了解了西藏口岸蝇类携带病原体情况。本研究的细菌鉴定采用16S rRNA测序和全自动微生物鉴定仪生理生化鉴定相结合的方法进行，2种方法相互补充，弥补了使用其中一种方法不能得到鉴定结果的不足。

从西藏口岸捕获的30种蝇类中共检出37种致病菌，均为条件致病菌，其中粪肠球菌在不同种类的蝇中携带率最高，除粗足裸金蝇（Achoetandrus villeneuvii）外其他蝇种均有携带。有研究表明，粪肠球菌可引起严重的院内感染，可能引发危及生命的腹腔感染和败血症等^[4-5]。蝇类中细菌携带率较高的是乌拉尔丽蝇、巨尾阿丽蝇、新陆原伏蝇和丝光绿蝇，可能与不同蝇种的孳生环境有关，以上几种蝇类均孳生于粪便、垃圾、腐败动物质中，成虫喜在腥臭环境活动，繁殖期常飞入室内、食品店、菜市场等，给人类的生产生活环境造成反复污染。

西藏口岸蝇类感染率最高的细菌是粪肠球菌，其次是蜂房哈夫尼亚菌、威斯康星米勒菌、大肠埃希菌、普通变形杆菌、耐久肠球菌等。该结果与其他口岸的检测结果有一定的相似性^[6-7]。西藏口岸蝇类的病毒检测检出1例轮状病毒阳性（A型），为新陆原伏蝇携带，检出率为2.0%。轮状病毒是引起婴幼儿秋季腹泻的一个重要病原体^[8]，由蝇类活动导致的食物水源污染应引起高度重视。

通过对西藏口岸蝇类病原体的检测，掌握西藏口岸蝇类携带病原体的基础数据，为下一步开展口岸蝇类监测及重点灭蝇、防蝇措施提供科学依据。加强国境口岸蝇类监测及消杀，是有效地防止疾病传入传出的一个重要手段。