中国媒介生物学及控制杂志  2019, Vol. 30 Issue (1): 7-11
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白纹伊蚊(Aedes albopictus)是全球最具侵袭性的蚊种[1], 可传播登革热、基孔肯雅热、寨卡病毒病、黄热病等多种重要传染病。随着全球轮胎贸易的日益频繁, 孳生在其中的白纹伊蚊在全世界扩散。目前该蚊已在全球70多个国家有分布。白纹伊蚊在我国的分布十分广泛, 北至辽宁省, 南至海南省, 西至西藏自治区[2]。近年来, 我国云南、广东、浙江、福建等多个省份有登革热疫情暴发, 在疫情处置中媒介伊蚊的防控多以化学杀虫剂快速降低成蚊密度为主。大量、广泛地使用杀虫剂, 不仅导致不同程度的抗药性产生, 而且不断发展[3], 从而加大了疫情防控难度。诸多研究表明, 击倒抗性(knockdown resistance, kdr)的分子机制为昆虫神经细胞膜上电压门控钠离子通道(voltage-gated sodium channel, VGSC)编码基因出现点突变, 导致相应氨基酸改变, 钠通道结构变化, 与杀虫剂的结合能力减弱, 敏感性降低[4]。不同蚊种kdr基因突变位点不同, 如三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)、中华按蚊(Anopheles sinensis)的主要突变位点为L1014[5-7], 埃及伊蚊(Ae.aegypti)的主要突变位点为S989和V1016[8], 白纹伊蚊的主要突变位点为F1534[9-10]。拟除虫菊酯类杀虫剂是目前蚊虫防控的主要杀虫剂, 其主要抗药性机制是kdr基因突变, 导致杀虫剂效果降低。
海南省位于我国的最南端, 2009年12月, 《国务院关于推进海南国际旅游岛建设发展的若干意见》正式印发[11], 海南省发展面临新的历史机遇。但是, 随着旅游和经贸的发展, 人流和物流急剧增加, 致使该区域的公共卫生安全风险增加。海南省是登革热既往流行区, 据历史纪录, 于20世纪70-80年代在海南全岛两次暴发流行, 波及周边多个市(县), 全省共报告登革热病例604 854例[12], 病死率达78.5/10万[13]。在国际旅游岛建设的大背景下, 作为海南省的省会城市, 海口市2015年开始组织开展"双创"(创建全国文明城市、国家卫生城市)活动[14], 其中病媒生物防控是"双创"的重要内容, 由于期间对蚊虫密度的强制要求, 杀虫剂的使用依然是蚊虫防控的首选。因此, 针对登革热媒介伊蚊的抗药性监测成为当地的重点工作之一。2015年, 王晓花等[10]通过生物测定实验和分子实验结合的方式进行调查, 发现海口市的白纹伊蚊已经产生抗药性, 之后经过为期3年的卫生城市创建和健康城市创建, 其kdr基因的突变情况和不同区域的分布特征尚不清楚。我们于2018年6-7月, 在海口市区不同方位采集白纹伊蚊, 检测其kdr基因的发展情况, 快速了解当前白纹伊蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性趋势, 为疫情防控提供依据。
1 材料与方法 1.1 试虫来源2018年6-7月, 在海口市区范围内选择东、南、西、北、中5个方位有代表性地区(表 1), 采集白纹伊蚊幼虫和蛹, 饲养至成蚊。5个采集点分别为海口市的琼山区云龙镇高园村(东部, 云龙镇)、秀英区永兴镇杨耀南村(南部, 永兴镇)、秀英区西秀镇儒宗村(西部, 西秀镇)、美兰区新华街道横沟村(北部, 横沟村)和秀英区秀英街道秀中社区工业水库C区(中部, 秀中社区)。5个种群共采集蚊虫94只。
DNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司, Taq PCR预混液购自北京全式金生物技术有限公司, 引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。
1.3 kdr基因型检测 1.3.1 蚊虫全基因组DNA的提取经形态鉴定为白纹伊蚊的单只成虫样本, 置于百泰克试剂盒中, 按照说明书提取基因组DNA。
1.3.2 kdr基因的扩增和测序以基因组DNA为模板扩增白纹伊蚊的VGSC基因部分片段, 参照文献[15]合成引物, 引物序列为正向aegSCF7:5'-GAG AAC TCG CCG ATG AAC TT-3', 反向aegSCR7:5'-GAC GAC GAA ATC GAA CAG GT-3'。PCR反应体系中包含2×Taq PCR预混液12.5 μl, 10 μmol/L正、反向引物各1 μl, 加双蒸水至25 μl。反应条件:94℃ 2 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共35个循环; 72℃ 8 min, 4℃保存。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后, 条带清晰无拖尾的PCR产物送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。
1.3.3 序列对比和统计学分析应用Seqman、Bioedit、MEGA 7.0软件对测得的VGSC基因部分序列进行峰图比对和分析, 观察各位点的突变情况, 确定等位基因类型和基因型, 分别统计和计算各采集地试虫kdr等位基因和基因型频率。
2 结果 2.1 kdr的等位基因和基因型本研究共获得94条DNA序列, 在GenBank上进行BLAST比对, 与白纹伊蚊VGSC基因第3编码区的部分序列(KC152046.1)一致性达99.00%, 证实所得序列为白纹伊蚊kdr基因部分片段。测得的DNA序列中, 单个碱基信号双峰, 说明该样本为杂合子, 见图 1。
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| 图 1 海口市白纹伊蚁kdr基因测序3种最常见的峰图 Figure 1 The three most common peaks of kdr gene sequencing in Aedes albopictus in Haikou city |
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对获得的94只白纹伊蚊kdr基因部分片段进行序列比对分析发现, F1534位点存在突变。1534位点共有4种等位基因, 即编码苯丙氨酸的野生型TTC/F (113/60.11%), 编码丝氨酸的突变型TCC/S (66/35.11%)和TCG/S (1/0.53%), 编码半胱氨酸的突变型TGC/C (8/4.26%); 6种基因型分别为野生型纯合子F/F (39/41.49%), 野生/突变型杂合子F/S (33/35.11%)、F/C (2/2.13%), 突变型纯合子S/S (15/15.96%)、C/C (1/1.06%)和突变型杂合子S/C (4/4.26%), 见表 2。
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在5个采样点中, 云龙镇以野生型TTC/F为主, 占85.48%;秀中社区和西秀镇的等位基因突变型TCC/S突变率最高, 分别为53.57%和52.78%, 其次是永兴镇和横沟村, 分别为46.15%和30.56%, 云龙镇最低, 为14.52%;等位基因突变型TGC/C, 突变率从高到低依次为秀中社区(14.29%)、横沟村(8.33%)和永兴镇(3.85%)。其他等位基因突变型即TCG/S仅秀中社区有1例(3.57%), 见表 2。
白纹伊蚊kdr突变基因型的情况, 云龙镇以野生型纯合子F/F为主, 占70.97%。对于F/S野生/突变型杂合子基因型, 西秀镇突变率最高, 为50.00%, 其他依次为永兴镇(38.46%)、横沟村(33.33%)、云龙镇(29.07%)和秀中社区(28.57%)。突变型纯合子中S/S突变率最高的是秀中社区, 为35.71%, 见图 2。
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| 图 2 海口市白纹伊蚁kdr突变等位基因及其突变基因型的类型和频率 Figure 2 Types and frequencies of alleles and genotypes of kdr mutations in Aedes albopictus populations in Haikou |
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本次研究发现, 海口市白纹伊蚊的神经细胞膜上VGSC编码基因出现点突变, 与王晓花等[10]2015年的研究结果一致, 均以F1534S为主, 但2015年野生型纯合子基因型频率为62.15%, 而本研究中野生型纯合子基因型频率已经降到41.49%, 可能与当地"双创"、卫生城市的巩固和登革热输入病例的媒介蚊虫防控等活动中杀虫剂使用有关; 也与高景鹏等[16]报道的2016年海口市多个地区白纹伊蚊对溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯和顺式氯氰菊酯类杀虫剂效果不明显一致。可见, 海口市白纹伊蚊对目前常用的拟除虫菊酯类杀虫剂已经产生抗药性, 且其抗药性还在发展过程中, 应调整当地主要杀虫剂的选用, 延缓白纹伊蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性的发展。
为了巩固"双创"成果, 预防控制登革热疫情, 海南省各级政府都加大了重要病媒生物的防控力度, 并通过政府采购方式, 将有害生物防控工作交给有害生物防治(PCO)公司完成, 无论是登革热疫情蚊虫防控, 还是创卫和巩固"双创"成果, 化学杀虫剂的使用不可避免[16], 应加强对参与蚊虫防控的PCO公司的科学应用指导。
本研究还检测到一种新的等位基因突变型TCG/S。陈翰明等[4]在我国的kdr基因报告中检测到上海市杨浦区、江苏省南京市、云南省景洪市的白纹伊蚊种群中kdr基因有I1532位点的突变, 但本研究并未检测到, 说明可能该位点突变还未扩散到海口地区。
在海口市采集的5个种群突变情况各不相同, 东部地区云龙镇比其他几个采样点野生型纯合子基因型频率明显要高(70.97%), 这可能与当地的用药情况相关, 云龙镇采集的生境为某一菜园, 人员相对较少, 而其他几个地区多为居民区, 针对蚊虫的产品使用较多, 使得这些地区的蚊虫有更高的抗性。
从分子层面探究登革热媒介伊蚊的抗性机制, 无疑更精细也更有说服力。我国各抗药性监测点目前最通用的抗性监测方法依然是生物测定法, 不仅工作量大, 而且实验设计粗糙, 受试虫状态及实验条件的影响较大, 所以得到的结果可靠性差。蚊虫抗药性的机制除kdr基因突变外, 还有其他多种机制, 如乙酰胆碱酯酶基因也属于靶标抗性机制的一种[17-18], 其他如代谢抗性, P450[19]与多种杀虫剂的抗药性有着一定关联, 但是具体方法及作用机制还需要进一步探索。今后的工作中, 应尽量全面地探究相应的方法, 检测白纹伊蚊相关的多种基因, 为以后的蚊虫防控做好基础工作。对于基层抗药性监测点, 方法的普及和应用也是一个难点, 因此, 如何推广简单易行的基因监测方法, 也是未来要考虑的一个重要方向。
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表1(Table 1)
