莱姆病是一种全球性的虫媒传染病，是由伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）感染，经蜱传播所致的自然疫源性人、畜共患传染病^[1]。1977年在美国首次发现人感染莱姆病^[2]，中国于1985年在黑龙江省林区首次发现莱姆病患者，目前我国至少有29个省（直辖市、自治区）报告莱姆病患者。美国每年有3 000~30 000人患莱姆病，该病被美国列为极为严重的公共卫生问题^[3]。

分子生物学实验证实，携带病原体的蜱种主要为中华硬蜱（Ixodes sinensis）和长角血蜱（Haemaphysalis longicornis），携带病原体的动物主要是啮齿类，其中已在黄胸鼠（Rattus tanezumi）、黑线姬鼠（Apodemus agrarius）等10余种鼠类中检出该病原体^[4]，这些鼠类为病原体及蜱类寄生提供了有利条件。开化县地形以山地和丘陵为主，森林覆盖率80.70%，这为蜱生长提供了良好的生态环境。相关文献报道和现场监测发现开化县蜱的莱姆病血清学阳性^[4]，因此，掌握开化县鼠类分布及其伯氏疏螺旋体携带状况对莱姆病防控具有重要意义。

2015—2016年每年的4—11月，在开化县选择农田、荒坡、林地和山区等生境，用5 m笼线法，每天室外布鼠笼100个，每5 m 1个，50 m 1行，用油条作诱饵，晚放（17：30—18：00）晨收（06：00—06：30），连续布放3 d。室内选择20户，每户室内布笼5个，连续布放3 d，每天布鼠笼100个。

对捕获鼠进行编号，记录鼠种类、捕获地点。现场无菌解剖取鼠脾，置液氮保存，带回实验室检测。

试剂：组织基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit）、2×Taq MasterMix，为天根生化科技（北京）有限公司产品，PCR相关试剂购自宝生物工程（大连）有限公司。仪器：GeneAmp PCR System 9700（ABI，USA），ChemiDoc XRS+（BIO RAD，USA）。

按照组织基因组DNA提取试剂盒说明书，对鼠的脾组织样品进行DNA提取。

根据参考文献选择巢式PCR扩增伯氏疏螺旋体5~23S rRNA间隔区250 bp目的片段。引物序列^[5]见表 1。反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察结果。

表 1 实验所用引物序列 Table 1 Primers information

表选项

选取的部分PCR扩增阳性的核酸片段由军事医学科学院进行序列测定。对测序后的序列利用www.blast.ncbi.nlm.nih.gov提供的程序进行同源性比对，应用MEGA 5.0软件分析进化关系。

共捕获鼠类149只，其中室内23只，室外126只。黑线姬鼠捕获数量最多共74只，均在室外捕获，青毛鼠（Berylmys bowersi）和东方田鼠（Microtus fortis）捕获最少，各1只，北社鼠（Niviventer niviventer）、针毛鼠（Niviventer fulvescens）、褐家鼠（Rattus norvegicus）、黄胸鼠和白腹巨鼠（Rattus edwardsi）的捕获数及构成比见表 2。

表 2 浙江省开化县室内外捕获鼠种分布情况 Table 2 The rodent species indoor and outdoor in Kaihua county, Zhejiang

表选项

对采集的149份鼠脾进行巢式PCR检测，10份标本中检测出伯氏疏螺旋体，总阳性率为6.71%。除青毛鼠和东方田鼠外，其他鼠种均有检出，见表 3。白腹巨鼠的检出率最高，为33.33%，北社鼠和针毛鼠次之，均为10.00%。在室内的黄胸鼠（1只）和针毛鼠（1只）中检测出阳性，在室外的黑线姬鼠（3只）、北社鼠（2只）、白腹巨鼠（1只）、针毛鼠（1只）和褐家鼠（1只）中检测出阳性。

表 3 浙江省开化县149份鼠脾中伯氏疏螺旋体检出情况 Table 3 The results of detected Borrelia burgdorferi from 149 rodents in Kaihua county, Zhejiang

表选项

将针毛鼠、北社鼠和褐家鼠中检测出的伯氏疏螺旋体分别命名为Quzhou.01、Quzhou.02和Quzhou.03。对该3种序列作进化关系分析，用邻接（Neighbor-Joining，NJ）法构建进化树（Bootstrap＝1 000），Quzhou.01、Quzhou.02、Quzhou.03序列分别与我国西藏自治区、湖南省及捷克共和国检测出的序列相近，见图 2。

图 2 浙江省开化县鼠类携带伯氏疏螺旋体的系统进化分析 Figure 2 The phylogenetic tree of Borrelia burgdorferi in rodents in Kaihua county, Zhejiang

图选项

莱姆病作为近年来新发的蜱媒传染病，已成为全球公共卫生问题^[6]。莱姆病的病原体伯氏疏螺旋体，主要在媒介和宿主之间循环，其宿主是重要的传染源，最常见的为犬与多种啮齿类动物^[7]。因此，检测鼠类伯氏疏螺旋体感染情况，对防控人莱姆病具有重要意义。本研究采用巢式PCR，对标本进行两轮PCR扩增，有效提高了实验的灵敏度，同时2对特异性引物的应用，使特异度也得到提高^[8]。目前该方法已广泛用于伯氏疏螺旋体检测。

在美国主要的鼠类宿主为白足鼠（Peromyscus leucopus），日本和中国姬鼠属为主要宿主^[9-10]。近年来调查显示，浙江省中东部北社鼠中伯氏疏螺旋体分离率较高^[11]。开化县位于浙江省西部，从该地区采样点捕获的鼠类来看，优势鼠种为黑线姬鼠、北社鼠和针毛鼠，这3种鼠也是浙江省的优势鼠种。从伯氏疏螺旋体的阳性率来看，白腹巨鼠的阳性率最高（1/3，33.33%），其次是北社鼠和针毛鼠（10.00%）。白腹巨鼠的感染率高可能与检测的样本量少有关。北社鼠和针毛鼠感染率较高，与孟真等^[11]的研究结果一致，提示该地区北社鼠和针毛鼠可能是伯氏疏螺旋体的重要宿主。

据报道，全球伯氏疏螺旋体至少可分为14个基因型，中国大陆确认的伯氏疏螺旋体主要包括：B. garinii、B.valaisiana、B. sinica、B. afzelii相关基因型和B. burgdorferi sensu stricto^[12]。在中国南方以B. afzelii、B. valaisiana和B. burgdorferi secsu stricto基因型为主^[13]。针毛鼠、北社鼠和褐家鼠中检出的伯氏疏螺旋体序列分别与我国西藏自治区、湖南省及捷克共和国的序列相近。针毛鼠、北社鼠中伯氏疏螺旋体为B. burgdorferi sensu stricto，褐家鼠中伯氏疏螺旋体为B. valaisiana，提示在开化县鼠类中至少存在2种基因型的伯氏疏螺旋体，且不同鼠种携带的伯氏疏螺旋体基因型可能不同。

开化县的开化国家公园，为我国9个国家公园体制试点之一，位于钱塘江上游，皖、浙、赣3省7县交界处，属于亚热带季风气候，四季分明、降雨丰沛，常年气温在16.3~17.3 ℃。该地区山区面积大，植被丰茂，与衢州市相邻的江西省安徽和福建省均有莱姆病自然感染的报道^[4]，莱姆病感染的潜在风险较高。国家公园建设的推进，当地旅游事业的蓬勃发展，以及人群频繁的户外活动都大大提高了与蜱接触的机会，蜱媒传染病的发病风险也不断增加，因此，应继续加强野生动物中莱姆病病原体的监测，密切关注人群莱姆病发病状况。