臭虫属于半翅目（Hemiptera）异翅亚目（Heteroptera）臭虫科（Cimicidae）。臭虫科包含6亚科22属近90种，在我国与人类有密切关系和医学意义的仅有臭虫属（Cimex）的2种，即热带臭虫（C. hemipterus）和温带臭虫（C. lectularius）。温带臭虫和热带臭虫嗜吸人血，导致局部皮损，奇痒难忍，有时可能引起强烈的过敏反应，出现丘疹样荨麻疹，还可能出现臭虫抗原引起的过敏性哮喘。自然条件下在臭虫体内可检测到普氏立克次体、克氏锥虫、班氏丝虫等病原体，存在传染疾病的风险^[1]。温带臭虫和热带臭虫外部形态相似，差别细微，仅靠成虫的形态特征有时难以准确鉴定，对于形态不完整的成虫、幼虫、卵或者残肢等更难以鉴别，对臭虫的分类鉴定造成一定困扰。随着分子生物学的发展，特别是DNA测序技术的普遍应用，致使许多学者从形态分类学研究转向应用DNA条形码等分子生物学方法来分析和解决近缘种的分类问题，其中线粒体基因和核糖体基因应用最广泛^[2]。

细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COI）基因是线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ编码蛋白基因，在半翅目中全长1 400 bp左右，也是动物分子系统学中应用频率较高的一种线粒体基因^[3]。COI基因的不同区段由于功能差异，进化速度不同，适合解决从高级阶元到亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系^[4]。16S rDNA是编码线粒体中16S RNA的基因，全长1 400~1 700 bp，是目前在昆虫分子系统学中被经常应用的分子标记。线粒体的16S rDNA是动物种内个体间较为保守的序列，改变速率较为缓慢，适合于高级阶元分类^[5]。28S rDNA是真核生物的染色体上编码核糖体大亚基RNA的基因，全长4~5 kb，是研究生物高级阶元系统发育较好的分子标记，28S rDNA保守的序列中含有12个高变区（D1~D12），可用来解决从种到科水平上的系统发生关系^[6]。ITS2是内转录间隔区，进化速度快，能提供系统分类学中可遗传性状，适合于种或种下水平的分析。由于具有很高的可变性，是区分种群和研究种系之间关系的最适宜进化速率的基因，因此被广泛应用^[7]。本研究通过形态的对比并利用线粒体基因COI、16S rDNA和核糖体基因28S rDNA、ITS2来鉴定与区别热带臭虫和温带臭虫。

热带臭虫采自深圳市某大学集体宿舍，温带臭虫采自山东泰安市某大学集体宿舍，所有标本均采集于2017年7月。

将采集的臭虫制作成干制标本，在体视显微镜下观察臭虫标本，根据《医学昆虫学》^[1]检索鉴定。

取臭虫的1条后足用于基因组DNA的提取，按TIANGEN公司生产的TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒的使用说明书进行基因组DNA提取。

DNA的扩增和PCR产物的纯化参照Yue等^[8]方法。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成（表 1），EX-Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR试剂从宝生物工程（大连）有限公司购置。

表 1 实验用引物序列信息^[5] Table 1 Information of the primers

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将PCR产物送上海立菲科技有限公司测序，测序引物同扩增引物。利用MEGA 6.0软件寻找测序结果的引物并将其去除，得到有效序列；将有效序列提交于美国国立生物技术信息中心（NCBI）进行结果比对；用MEGA 6.0软件分析处理有效序列并生成Neighbor-Joining（NJ）进化树^[9]。

从GenBank中搜索并下载热带臭虫和温带臭虫的COI、16S rDNA、28S rDNA、ITS2序列，Anthocoris nemorum的COI序列，A. confusus的16S rDNA序列和Cacodmus vicinus的ITS2序列，用于比对与分析。

根据臭虫的形态描述检索鉴定标本，比对两者的前胸背板、足、翅基及腹部等特征，可看出热带臭虫与温带臭虫之间存在区别，具体区别特征见图 1，区别特征描述见表 2。

注：A.热带臭虫前胸背板；B.温带臭虫前胸背板；C.热带臭虫翅基与第1腹节；D.温带臭虫翅基与第1腹节；E.热带臭虫第3~5腹节及交合口；F.温带臭虫第3~5腹节及交合口；G.热带臭虫胫端毛刺；H.温带臭虫胫端毛刺 图 1 热带臭虫与温带臭虫（雌）特征的区别 Figure 1 The morphological differences between Cimex hemipterus and C. lectularius (female)

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表 2 温带臭虫与热带臭虫的区别特征 Table 2 The morphological differences between Cimex hemipterus and C. lectularius

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将PCR扩增并去掉引物的有效序列16S rDNA、28S rDNA提交到NCBI进行BLAST分析，其中16S rDNA的结果与形态鉴定结果一致，热带臭虫28S rDNA与形态鉴定结果一致，由于GenBank缺乏温带臭虫28S rDNA的序列，因此没有准确的对比结果。

利用有效的16S rDNA、28S rDNA序列和从GenBank下载2种臭虫的COI、16S rDNA、28S rDNA、ITS2序列进行比对分析，添加A. nemorum的COI，A. confusus的16S rDNA和C. vicinus的ITS2作为外源种，构建4种基因的NJ进化树，物种与4种基因的详细信息见表 3。

表 3 不同物种与4种基因的信息 Table 3 Information of four genes and species

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从表 4可看出，热带臭虫与温带臭虫COI的种内碱基数差异为0，相似度达到100%，而种间的碱基差异达到18.7%；从图 2 COI的NJ进化树上看，温带臭虫与热带臭虫各自聚为一支，支持率达到100%。说明COI基因在热带臭虫与温带臭虫之间有明显差异，可以用于鉴定和区分这2种近似种。

表 4 热带臭虫与温带臭虫COI种内、种间的碱基差异数和百分比(%) Table 4 Intra-species and inter-species base pair variation of COI for Cimex hemipterus and C. lectularius

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图 2 热带臭虫与温带臭虫COI的NJ进化树 Figure 2 Neighbor Joining tree based on COI

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从表 5可看出，热带臭虫与温带臭虫16S rDNA的种内碱基数差异为0，相似度达到100%，而种间的碱基差异达到8.7%；从图 3 16S rDNA的NJ进化树上看，温带臭虫与热带臭虫各自聚为一支，支持率达到100%。说明16S rDNA基因在热带臭虫与温带臭虫之间有明显差异，可以用于鉴定和区分这2种近似种。

表 5 热带臭虫与温带臭虫16S rDNA种内、种间的碱基差异数和百分比(%) Table 5 Intra-species and inter-species base pair variation of 16S rDNA for Cimex hemipterus and C. lectularius

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图 3 热带臭虫与温带臭虫16S rDNA的NJ进化树 Figure 3 Neighbor-Joining tree based on 16S rDNA

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从表 6可看出，热带臭虫与温带臭虫28S rDNA的种内碱基数差异为0，相似度达到100%，而种间的碱基差异达到19.5%；从图 4 28S rDNA的NJ进化树上看，温带臭虫与热带臭虫各自聚为一支，支持率达到100%。说明28S rDNA基因在热带臭虫与温带臭虫之间有明显差异，可以用于鉴定和区分这2种近似种。

表 6 热带臭虫与温带臭虫28S rDNA种内、种间的碱基差异数和百分比(%) Table 6 Intra-species and inter-species base pair variation of 28S rDNA for Cimex hemipterus and C. lectularius

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图 4 热带臭虫与温带臭虫28S rDNA的NJ进化树 Figure 4 Neighbor-Joining tree based on 28S rDNA

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从表 7可看出，热带臭虫ITS2的种内碱基数差异为1，相似度达到99.9%，温带臭虫的种内碱基数差异为0，相似度达到100%，而种间的碱基差异达到13.9%~14.2%；从图 5 ITS2的NJ进化树上看，温带臭虫与热带臭虫各自聚为一支，支持率达到100%。说明ITS2基因在热带臭虫与温带臭虫之间有明显差异，可以用于鉴定和区分这2种近似种。

表 7 热带臭虫与温带臭虫ITS2种内、种间的碱基差异数和百分比(%) Table 7 Intra-species and inter-species base pair variation of ITS2 for Cimex hemipterus and C. lectularius

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图 5 热带臭虫与温带臭虫ITS2的NJ进化树 Figure 5 Neighbor-Joining tree based on ITS2

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热带臭虫和温带臭虫作为医学昆虫，不仅滋扰人类的生活，还有可能传播病原体。对于热带臭虫和温带臭虫的分类鉴定，一般通过成虫外部形态来鉴别。虽然热带臭虫与温带臭虫的地域分布有明显差异^[10]，但是由于现代交通便利和贸易交流频繁等，有可能导致臭虫随着交通工具或贸易的货物被带到不同的地方，因此从地理分布确定臭虫的种类并不完全准确。随着DNA分子技术的发展，并且应用于物种的分类鉴定，特别是线粒体基因和核糖体基因的广泛应用，使热带臭虫和温带臭虫的鉴定与区分不再是单一的形态鉴定。

将获得的16S rDNA和28S rDNA序列进行对比，对比结果与形态鉴定结果一致，相似度均达到100%，种内差异均＜2%，种间差异均＞2%。比较分析从GenBank下载的2种臭虫的COI和ITS2基因，相似度均达到99%以上，种内差异均＜2%，种间差异均＞2%。从4个基因的NJ进化树看，2个种均能各自聚为一支，支持率均达到100%，由此看出，无论是线粒体基因的COI、16S rDNA还是核糖体基因的28S rDNA、ITS2，均能很好地鉴定与区分这2种臭虫。因此，这4种基因可用作热带臭虫与温带臭虫2种近似种鉴定与区别DNA的分子标记。但由于数据库中数据有限，分析的个体数不够多，随着分析个体数量的增多种内个体间的碱基差异有可能不均为0。

DNA分子标记已应用于多种医学昆虫近似种的鉴定与区别^[11-13]，由于分子标记不受虫态的影响^[14]，对于形态学难以鉴定的卵和幼虫进行鉴定更方便、准确，形态与分子相结合的方法鉴定与区别近似种，可以相互验证，使结果更为准确，为难以快速鉴别的近似种的鉴定提供有效的方法和有力保证。