疟疾是由疟原虫感染引起的一种蚊媒传染病，死亡率高，具有严重的社会危害性。据WHO世界疟疾报告指出，2016年全球共报告2.16亿疟疾病例，44.5万余人死亡^[1]。随着我国对消除疟疾工作的重视和广泛开展，疟疾防治工作取得了很大进展，疟疾病例逐年下降。河南省是我国主要的疟疾流行区之一，20世纪70年代发病率曾高达1 694.40/万，经过多年防治，90年代已达到基本消除疟疾标准^[2-3]。

河南省自2012年至今已连续5年无本地疟疾病例报告，但由于河南省是劳务输出大省，每年到非洲、东南亚等疟疾高发地的务工人员不断增加，对出国务工人员的疟疾监测显得尤为重要。本研究通过对河南省2016年部分输入性疟疾病例的3种实验室检测方法进行比较，并对患者流行病学资料进行分析，期望给发热病例的疟疾筛查提供快速精确的检测方法。

选择河南省2016年10－12月网络直报为疟疾病例的血液样本作为研究对象。

姬氏染液购自珠海贝索生物技术有限公司，疟原虫检测试剂由广州万孚（Wondfo）生物技术股份有限公司生产；核酸提取试剂盒购自德国Qiagen公司；PCR Master Mix购自美国Promega公司。主要仪器有显微镜（菲律宾，Olympus CX31），PCR扩增仪（美国，Bio-rad iQ5），凝胶成像系统（美国，Bio-rad Geldoc XR）。

按照中华人民共和国卫生行业标准——疟疾诊断标准（WS 259－2015）附录B《病原学检查》规范要求，将涂制好的厚薄血膜进行姬氏染色，于油镜视野（×1 000）下观察，并鉴定疟原虫虫种类型。

按照疟原虫检测试剂使用说明书进行检测，15 min内读取结果。

采用DNA提取试剂盒提取抗凝全血核酸，-20 ℃保存。对提取出的全血核酸进行巢氏PCR扩增，引物序列见表 1。反应体系（20 μl）：2×PCR Master Mix 10 μl，正、反向引物各0.6 μl，提取出的DNA模板（50 ng/μl）2 μl，ddH₂O补至20 μl（第1轮）。反应程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s；72 ℃ 5 min，其中步骤2~4循环30次。取第1轮扩增产物1 μl作为模板DNA进行第2轮PCR扩增，反应体系和反应程序同第1轮。最终的扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像系统中观察结果。

表 1 巢氏PCR检测疟原虫种类的引物序列

表选项

对37例网络直报为疟疾的病例从输入地来源、临床表现、年龄、性别和职业等方面进行流行病学调查和分析。

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计学分析，率的比较采用χ²检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

37份疟疾样本血涂片镜检阳性34例，3例阴性，阳性率为91.89%；PCR检测阳性35例，2例阴性，阳性率为94.59%；快速诊断试剂检测RDT（rapid diagnostic test）阳性数35例，阴性2例，阳性率为94.59%。根据患者流行病学史，临床表现，并综合3种检测方法，最终确诊35例，其中恶性疟25例、间日疟2例、卵形疟6例、三日疟1例、混合感染1例，阴性2例，阳性率为94.59%，恶性疟、间日疟、卵形疟、三日疟和混合感染所占比例分别为67.57%、5.41%、16.22%、2.70%和2.70%。4种疟原虫巢氏PCR扩增产物长度片段见图 1。3种检测方法阳性率比较差异无统计学意义（χ²＝0.305，P＝0.859），巢氏PCR和镜检结果见表 2。

注：Pv.间日疟原虫；Pf.恶性疟原虫；Pm.三日疟原虫；Po.卵形疟原虫；（-）.阴性对照；M. DNA标志物 图 1 4种疟原虫PCR扩增结果 Figure 1 PCR result of four malaria samples

图选项

表 2 巢氏PCR和镜检两种方法对不同疟疾类型的检测结果比较

表选项

网络直报的37例疟疾病例均为输入性病例，输入地多为非洲国家，其中尼日利亚11例，喀麦隆4例，赤道几内亚和乌干达各3例，埃塞俄比亚、安哥拉、刚果金、加纳和莫桑比克各2例，其他非洲国家共6例。

本研究中的37例疟疾感染者主要症状为发冷、发热、出汗和乏力，其中，4例患者有腹泻症状（10.81%），体温＞39 ℃者有20例（54.05%）。37例疟疾病例中，16例患者在国外期间有疟疾发病史（43.24%），经抗疟药物治疗，有6例患者多次发病，甚至发病6次；8例（21.62%）患者在就诊时以感冒治疗，其中6例患者出国前无疟疾发病史。

37例疟疾病例均为男性，20岁以下1例（2.71%），45岁以上者9例（24.32%），其余在20~45岁之间（72.97%）。91.89%疟疾发病患者为外出务工人员。

检出的35例疟疾阳性患者，均被及时送至医院救治，并依据抗疟药使用规范（WS/T 485－2016）给予抗疟药物治疗，均得到有效治愈。

近年来，随着经济全球化发展以及对外交流的增加，河南省输入性疟疾病例数有上升趋势，且每年均有死亡疟疾病例发生。河南省是劳务输出大省，如何控制由于人口流动而导致的输入性疟疾病例的不断增加，是当前疟疾防治工作中所面临的新问题。

本研究发现，3种实验室检测疟原虫的方法阳性率差异均无统计学意义，但PCR对疟原虫虫种的鉴定灵敏性更高，与文献[4-5]报道相吻合。在对发热病例疟原虫筛查时，RDT简便快捷，但只能区分恶性疟和非恶性疟，无法对虫种进行鉴别，且在原虫密度较低或原虫形态不典型时，镜检容易导致误诊漏诊^[6-7]。PCR方法可以提高疟疾诊断的效率^[8-9]，但由于检测仪器和试剂价格昂贵、耗时长等原因，目前并没有完全普及，但PCR的高灵敏性不容忽视，且PCR可诊断混合感染。因此，在疟疾的诊断中，3种检测方法要综合判定。

流行病学分析发现，37例疟疾病例以青壮年男性务工人员为主，早期普遍症状是发冷、发热、出汗和乏力，半数以上（54.05%）患者体温＞39 ℃，43.24%的患者有过疟疾发病史。另外，有8例（21.62%）患者在出现发热、头痛症状就诊时被误诊为感冒治疗，治疗效果不明显后才考虑疟原虫检查，为此可能延误病情。由于恶性疟来势凶险，临床表现复杂多变，特别容易误诊，这就迫切要求加强临床医生培训，提升高疟区回国人员的疟疾防范意识和医务人员诊疗水平。

目前，河南省劳务输出国家主要是非洲，由于输出人群在境外居住环境相对较差、防蚊设施不健全，疟疾发病率较高，加之非洲国家医疗水平较低，导致在境外感染疟疾时不能得到及时和有效的治疗。所以，在传染病筛查时，一定要对从疟疾高发地区归国的人员进行疟原虫检查，特别是对体温高达39 ℃的发热病例，更不能掉以轻心。因此，加大涉外企业员工的疟疾宣传教育，加强对于来自高疟区归国人员的疟疾监测，提高疑似疟疾病例诊断的效率和医务人员的疟疾诊疗水平依然是当今河南省疟疾防治工作的重点。