流行性乙型脑炎（乙脑）病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），又称日本脑炎病毒，是一种蚊媒病毒。三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）是JEV的主要传播媒介，可引起乙脑，是一种人畜共患病。JEV具有神经细胞嗜性，能够感染脑实质并引起广泛病变，存活患者中大多存在神经系统后遗症^[1]。据国家卫生和计划生育委员会统计，2017年我国共有1 147例确诊患者，死亡79例^[2]。

小窝蛋白（caveolin，CAV），又称微囊蛋白，为小窝主要组成蛋白，属整合膜蛋白^[3]。目前研究表明，JEV主要通过小窝蛋白1（caveolin-1，CAV-1）介导的内吞作用入侵人神经细胞^[4]。为进一步研究其机制，需对CAV-1基因进行敲除。传统的基因沉默主要采用RNA干扰（RNA interference，RNAi），通过引入外源性的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）或短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）介导靶基因沉默，但该法敲除效率低，作用时间短，存在脱靶效应，且无法完全去除基因功能^[5-7]。因此，迫切需要一种高效的CAV-1敲除方法用以研究JEV致病机制。

近年来，成簇规律间隔的短回文重复序列（clustered regulatory interspaced short palindromic repeats，CRISPR）相关蛋白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）系统可对基因组进行简便和高效的编辑^[7]。因此本实验通过CRISPR/Cas9技术对SH-SY5Y细胞株的CAV-1基因进行敲除，从而研究它对JEV感染性的影响，为后续进一步研究JEV的细胞入侵机制提供可靠的实验平台和技术支持。

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞由本实验室保存。JEV病毒株SA14由俞永新教授惠赠。PX459质粒购自美国Addgene公司；Trans1T1感受态购自全式金公司；限制性内切酶BbsⅠ、T4 DNA连接酶和T4多聚核苷酸激酶购自美国NEB公司；质粒提取试剂盒购自德国Qiagen公司；Lipofectamine 3000转染试剂及羊抗兔Alexa Fluor 488荧光二抗购自美国Invitrogen公司；二盐酸嘌呤霉素购自美国Selleck公司；鼠抗人GAPDH单克隆抗体购自美国Proteintech公司；兔抗人CAV-1单克隆抗体购自美国Sigma公司；兔抗JEV NS3抗体购自美国GeneTex公司；DAPI购自瑞士Roche公司；DMEM培养基、细胞培养用青链霉素及胎牛血清为美国Gibco公司产品；质粒测序及寡核苷酸链合成由捷瑞生物公司完成。

根据CRISPR/Cas9靶点设计原则，选择CAV-1基因的第1个外显子区（expressed region 1，EXON1）和第2个外显子区（expressed region 2，EXON2）为靶位点，使用http://crispr-mit.edu/网站分别设计2个EXON的sgRNA序列，选取其中分数较高的序列，并在正向引物的5′端添加CACC，反向引物的5′端添加AAAC，使其与BbsⅠ酶切后的载体形成黏性末端互补。

取等量的正、反向引物，使其退火形成双链。反应体系：各取100 nmol正、反向引物sgRNA，1 μl 10×T4 Ligation Buffer，0.5 μl T4多聚核苷酸激酶加水至10 μl。反应程序：37 ℃ 30 min；95 ℃ 5 min；每分钟下降5 ℃，降至25 ℃。

使用BbsⅠ线性化PX459质粒，切胶回收。反应体系为：1 μg PX459载体，1 μl BbsⅠ，5 μl 10×NE Buffer，加水至50 μl。反应程序：37 ℃ 15 min。

线性化PX459载体50 ng，寡核苷酸双链产物150 ng，1 μl 10×T4 DNA连接酶缓冲液，1 μl T4 DNA连接酶，加水至10 μl。程序：25 ℃60 min。将产物转化Trans1-T1感受态，挑取单克隆进行摇菌，使用Qiagen质粒提取试剂盒提取质粒，进行酶切和测序验证。

使用DMEM培养基（含10%胎牛血清）常规培养SH-SY5Y细胞。转染前12 h，将SH-SY5Y细胞接种至24孔板中培养，转染时细胞汇合度达到60%~70%为宜。将构建的PX459-CAV-1重组质粒与PX459载体按照Lipofectamine3000转染说明书转入细胞内，并在5%CO₂、37 ℃培养箱中培养。

将PX459-CAV-1重组质粒转入SH-SY5Y细胞，48 h后更换含有2 μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基进行筛选。2 d后将筛选所得混合克隆取1/3细胞继续培养，余下2/3细胞提取蛋白，免疫印迹检测CAV-1的表达情况，确定效率最佳的重组质粒。利用稀释法对效率最佳的混合克隆进行单克隆筛选，将细胞接种到96孔板中（1个细胞/孔）。待细胞长满，移至24孔板中继续扩大培养，得到CAV-1敲除的SH-SY5Y细胞（SH-SY5Y-CAV-1-KO）。

将野生型SH-SY5Y（SH-SY5Y-WT）和筛选后得到的单克隆稳定株SH-SY5Y-CAV-1-KO分别接种至24孔板中培养。待细胞长满后，用PBS缓冲液洗涤细胞2次，加入100 μl RIPA裂解液，置于冰上裂解细胞，抽提细胞总蛋白，利用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度，经10%变性SDS-PAGE电泳后，用湿转化法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，使用5%脱脂牛奶的TBST溶液封闭2 h，CAV-1抗体4 ℃孵育过夜（稀释倍数1:1 000），TBST洗涤3次，用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h（稀释倍数1:1 000），TBST再洗涤，ECL化学发光后获得目的条带。

在96孔板内接种SH-SY5Y-WT和SH-SY5Y-CAV-1-KO，使感染时细胞密度达到70%左右，每孔加入感染复数（multiplicity of infection，MOI）为1的JEV，37 ℃感染2 h，去除病毒液并加入100 μl DMEM培养基，36 h后进行免疫荧光检测。

JEV感染36 h后，加入甲醇，置于-20 ℃ 20 min进行固定和透膜。PBS洗涤3次。每孔加入3%BSA封闭1 h。将JEV NS3抗体用1%BSA稀释（稀释倍数1:1 000），室温孵育2 h。加入羊抗兔的Alexa Fluor488进行二抗孵育（稀释倍数1:1 000），避光孵育1 h。最后DAPI（稀释倍数1:10 000）进行细胞核染色，通过荧光显微镜随机取视野拍照，计算视野内的细胞个数。结果以感染率=阳性细胞个数/总细胞个数表示。

通过SPSS 17.0软件对数据进行分析，数据采用x±s表示，两组间均数比较采用t检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。

针对CAV-1基因的EXON1和EXON2分别进行sgRNA设计。sgRNA正、反向引物见表 1。

表 1 小窝蛋白1基因各位点小向导RNA（sgRNA）及其序列 Table 1 The sequence of sgRNA of CAV-1 gene

表选项

利用限制性内切酶BbsⅠ对PX459-CAV-1-sgRNA-1和PX459-CAV-1-sgRNA-2进行酶切，结果见图 1A，连接成功的质粒不含有BbsⅠ酶切位点，因此不能被内切酶切割为线性。测序结果见图 1B，插入的sgRNA位置、方向及序列均正确，成功构建重组质粒。

注：A. PX459-CAV-1-sgRNA重组质粒的酶切结果；B. PX459-CAV-1-sgRNA重组质粒的测序结果 图 1 PX459-CAV-1-sgRNA重组质粒的鉴定 Figure 1 The identification of PX459-CAV-1-sgRNA recombinant plasmid

图选项

将PX459-CAV-1-sgRNA-1和PX459-CAV-1-sgRNA-2分别转染细胞并加药筛选2 d后，裂解各孔混合克隆的细胞蛋白，免疫印迹检测重组质粒的敲除效率，确定PX459-CAV-1-sgRNA-1的敲除效率最高（图 2）。培养PX459-CAV-1-sgRNA-1重组质粒转染的细胞，最终得到单克隆细胞。SH-SY5Y-WT中的CAV-1正常表达，而SH-SY5Y-CAV-1-KO中的CAV-1没有表达（图 3），SH-SY5Y细胞CAV-1基因敲除稳定株成功构建。

注：WT.野生型；1~2. PX459-CAV-1-sgRNA-1；3~4. PX459-CAV-1-sgRNA-2 图 2 免疫印迹对SH-SY5Y混合克隆细胞CAV-1表达的分析 Figure 2 The analysis of the expression level of CAV-1 in SH-SY5Y polyclonal cells by immunoblotting

图选项

注：WT.野生型；KO. CAV-1基因敲除型 图 3 免疫印迹对SH-SY5Y单克隆细胞CAV-1表达的分析 Figure 3 The analysis of the expression level of CAV-1 in SH-SY5Y monoclonal cells by immunoblotting

图选项

将野生型SH-SY5Y细胞（WT）与CAV-1敲除细胞株（KO）以相同的条件进行感染，36 h后进行免疫荧光检测JEV的感染性。与WT相比，KO对JEV的感染性明显下降（P < 0.001），见图 4。

注：WT.野生型；KO. CAV-1基因敲除型 图 4 免疫荧光检测野生型与CAV-1敲除细胞株对JEV的感染性 Figure 4 The detection of JEV infection on wild type cells and CAV-1 knockout cells by immunofluorescence

图选项

病毒入侵细胞是病毒利用宿主细胞的某些成分，促进其在细胞内的移行。目前，已发现JEV可以利用多种内吞机制来入侵细胞^{[4, 8]}。本课题组前期研究表明，CAV介导的内吞机制在JEV感染神经细胞中起主要作用。通过抑制CAV的表达有助于研究JEV的多种入侵途径，并且可为病毒的防治提供有力策略。然而采用RNAi只能在转录后水平下调CAV的表达，并不能完全抑制CAV的功能^[5]。

CRISPR/Cas9作为一项全新的基因编辑技术，拥有快速、可靠、高特异性以及高敲除效率等特点。该技术由两部分构成，即CRISPR和Cas9核酸酶（Cas9）^[9]。该系统原本是一种广泛存在于细菌和古生菌中的免疫机制，因其可特异结合并剪切DNA片段，有效抵御一系列外源性DNA侵染，因此近年来被广泛用于基因的定点修饰^[10-12]。其利用与目的基因同源的sgRNA，特异性结合靶细胞基因组的DNA，形成杂合双链，之后Cas9可对该双链进行切割，使得此段DNA双链断裂（double-strand breaks，DSB）。DSB可诱导产生位点特异性核酸酶，通过错误倾向的非同源末端连接进行修复，该修复将在断裂位点造成插入或缺失，使得基因编辑变得简便并且高效^[13]。

本研究将PX459质粒作为载体，分别以CAV-1基因的EXON1和EXON2为靶点设计了sgRNA，构建了PX459-CAV-1重组质粒，经酶切测序正确后，转染至SH-SY5Y细胞中，利用嘌呤霉素进行抗性筛选，最终筛选并获得CAV-1基因敲除稳定株。其中针对EXON1的PX459-CAV-1-sgRNA-1的敲除效率更高，而针对EXON2的PX459-CAV-1-sgRNA-2的敲除效率则较低，其可能是由于针对EXON2的sgRNA介导的Cas9核酸酶在靶点位置造成的突变并不能改变CAV-1蛋白的开放阅读框，不能达到完全敲除CAV-1基因的目的。故在设计sgRNA时，应尽量选取靠前的EXON，使其移码突变概率增加^{[10-11, 14]}。同时检测了敲除细胞株与野生型对JEV感染性的差异，结果表明，CAV-1基因敲除后，JEV对神经细胞的感染性明显降低，进一步证明小窝蛋白介导的内吞对JEV感染神经细胞尤为重要。目前，JEV入侵细胞的分子机制尚未完全阐明，本研究为进一步探索CAV-1在JEV感染神经细胞过程中的分子机制提供了有效的细胞模型。