四川省石渠县自1997年首次发现青海田鼠（Lasiopodomys fuscus）鼠疫疫源地以来，鼠疫防治工作人员在全省开展了鼠疫监测工作，已相继发现青藏高原青海田鼠鼠疫自然疫源地和青藏高原喜马拉雅旱獭（Marmota himalayana）鼠疫自然疫源地，分布于6个县^[1-3]。2015年在新龙县友谊乡检获的1只自毙旱獭中分离出1株鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis，鼠疫菌），确定该地为四川省新鼠疫疫源县。为调查鼠疫菌的差异区段（different region，DFR）基因型及新龙县鼠疫疫源地的性质，我们对该鼠疫菌进行了基因分型研究。

超纯水；含有Buffer、dNTP、Taq DNA聚合酶的PCR扩增混合液〔Taq Mix（2×Easy Taq^®TM PCR SuperMix+dye），北京全式金生物技术有限公司〕；TBE电泳缓冲液；琼脂糖；核酸染料；DNA Marker（100 bp Plus DNA Ladder Marker，北京全式金生物技术有限公司）。

PCR扩增仪、水平电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪。10、100、200、1 000 μl移液器及其枪头、0.2 ml PCR反应管、1.5 ml EP管、离心机（可调14 000 r/min）。

选取来源于四川省鼠疫疫源地的16株鼠疫菌，包括新龙县1株，石渠、德格、巴塘、理塘和雅江县各3株，菌株涵盖了四川省所有鼠疫疫源县，菌株信息见表 1。

表 1 四川省鼠疫疫源地鼠疫菌菌株信息 Table 1 Information of Yersinia pestis strains from enzootic plague foci in Sichuan

表选项

将鼠疫菌接种于赫氏平板上，28 ℃培养24 h，按照Wizard Genomic DNA Purifcation Kit操作规程在中国CDC传染病预防控制所的P3实验室提取鼠疫菌核酸。

23个DFR和pMT1扩增引物^[4]由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，按照引物检测报告说明使用。PCR反应体系25 μl：超纯水9.5 μl，2×PCR Supermix 12.5 μl，正、反向引物各1 μl，模板1 μl。PCR扩增条件：预变性95 ℃ 3 min；变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，共30个循环；再延伸72 ℃ 5 min。DFR18和DFR19的退火温度为56 ℃，其他条件不变，同时用鼠疫菌株EV76作为阳性对照。PCR扩增产物取5 μl并用Goldview染色后，经过1.5%琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪下读取结果，出现相应条带者判为“0”，未出现条带者判为“1”。结果利用Excel 2007软件保存。

运用Excel 2007软件对数据进行整理，采用BioNumerics 6.6软件进行数据分析。

石渠县菌株DFR06、DFR11、DFR12、DFR13、DFR18、DFR19、DFR20和DFR23片段缺失，查询DFR基因库，菌株DFR分型为Genomovar14型；德格、巴塘、理塘、雅江和新龙县鼠疫菌菌株DFR01、DFR02、DFR13和DFR23片段缺失，查询DFR基因库^[5-6]，菌株DFR分型为Genomovar05型，见表 2。

表 2 四川省鼠疫菌差异区段分型结果 Table 2 DFR-genotype results of Yersinia pestis strains from Sichuan

表选项

鼠疫菌分为2类，石渠县青海田鼠菌株聚为第1类，为Genomovar14型；新龙、德格、巴塘、理塘、雅江县属于第2类，为Genomovar05型，见图 1。

图 1 四川省鼠疫菌差异区段聚类结果 Figure 1 DFR-genotype clustering results of Yersinia pestis strains from Sichuan

图选项

近年随着分子生物学技术的快速发展，利用分子生物学技术对鼠疫菌进行分型已成为研究鼠疫的重要方法之一，比较常见的方法有多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）、规律聚集的间隔短回文重复（CRISPR）、单核苷酸多态性（SNP）和DFR等^[7-10]。DFR分析的指标是细菌基因组中存在或缺失的基因片段，这些基因片段在鼠疫菌进化过程中表现出或存在、或缺失的基因现象，这种存在和缺失反映鼠疫菌自然选择条件下适应性进化。但DFR分析也有局限性，从实验结果可以看出，DFR分型只能区别疫源地种类，很难解释鼠疫菌株的进化关系。2015年在新龙县友谊乡友谊大草原发现的鼠疫自然疫源地位于沙鲁里山脉的素龙山以西地区，海拔 > 4 000 m，地处新龙、巴塘和理塘3县交界处，从表 2可见，新龙县鼠疫菌DFR型别与巴塘、理塘、雅江和德格县相同，均为Genomovar05基因型，而与石渠县青海田鼠的鼠疫菌DFR型别（Genomovar14）有差异；且德格、巴塘、理塘、雅江和新龙县同属于青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地，生态型与DFR分型结果一致；新龙县与巴塘、理塘和雅江县的鼠疫疫源地分布较近，均分布在素龙山、扎噶山、海子山和格聂山连线区域，鼠疫疫源地同处318国道附近。近些年，四川省甘孜藏族自治州（甘孜州）旅游业发展较快，沿318国道线进出甘孜州的人员逐年增加，但人们对鼠疫防治知识较为欠缺，鼠疫严重威胁当地农牧民和外来游客的生命健康。因此，新龙、巴塘、理塘和雅江县应在鼠疫防治策略上形成联防联控机制，加大鼠疫宣传教育力度，严防人间鼠疫发生。