虫媒病毒是在蚊、蜱、白蛉、蠓等吸血昆虫体内繁殖，通过叮咬将病毒传播给人、畜动物的一类病毒^[1]。1992年在国际虫媒病毒中心注册的虫媒病毒有535种，其中有128种可能使人、畜引起疾病，在已知的虫媒病毒中，以蚊虫为传播媒介的蚊传病毒有300余种^[2]。目前在世界各地引发严重虫媒病毒病，如登革热、流行性乙型脑炎（乙脑）、寨卡病毒病等。患者主要表现为发热、皮疹、脑炎等临床症状，严重时危及生命。因此，蚊传虫媒病毒及其相关疾病对人类健康具有极大威胁，也是国际关注的公共卫生问题。

贵州省（103°36′~109°35′ E，24°37′~29°13′ N）位于我国西南部的内陆地区，与云南省和重庆市接壤。地貌类型多样，以山地为主，属于亚热带季风气候，复杂的地理位置、地形地貌以及多样的气候特征导致蚊虫以及携带虫媒病毒的多样性。此前在贵州省虫媒病毒调查中已检测到盖塔病毒和多株乙脑病毒^[3-4]；在当地发热患者标本中已检测到巴马森林病毒和罗斯河病毒的IgM抗体^[5]；贵州地区人群的血清抗体检测甲组病毒的抗体阳性率为32.69%^[6]。2016年本研究团队在贵州省德江县开展蚊虫和蚊传虫媒病毒调查，在当地采集的多种蚊虫中分离到乙脑病毒和版纳病毒，特别是在当地采集的致倦库蚊（Culex pipiens quinquefasciatus）和骚扰阿蚊（Armigeres subalbatus）中分离到寨卡病毒^[7-8]，这也是我国首次在自然界采集的蚊虫标本中分离到该病毒。为进一步了解德江县蚊虫及蚊传虫媒病毒的流行状况，我们于2017年再次在当地开展蚊虫及其蚊传虫媒病毒调查，现将结果报告如下。

2017年8月在贵州省铜仁市德江县龙泉乡居池坝村、青龙镇石打头村、江口县太平镇快场村的动物饲养圈使用紫外诱蚊灯（武汉市吉星环保科技有限责任公司）于20：00至次日07：00左右采集蚊虫。对采集的蚊虫标本在冰浴条件下进行形态学分类，按照采集环境和种类等信息（蚊虫50只/管）编号登记，立即放入液氮中保存并转移至实验室备用。

BHK-21细胞（金黄色地鼠肾细胞）、C6/36细胞（白纹伊蚊细胞）为本实验室保存。BHK-21细胞培养在90% Eagle’s（中国CDC病毒病预防控制所）、7%胎牛血清（FBS；Invitrogen）、1%的青霉素和链霉素（100 U/ml）、1%谷氨酰胺（30 g/L）、1% NaHCO₃；C6/36细胞培养在90% RMPI 1640（Invitrogen）、10%胎牛血清（FBS；Invitrogen）、1%的青霉素和链霉素（100 U/ml）。BHK-21、C6/36细胞分别在28、37 ℃ 5%CO₂培养箱中培养^[9]。

蚊虫50只/批，使用Tissuelyser振荡器（QIAGEN公司），频次为25次/s，振荡2 min。振荡后经4 ℃ 20 000×g离心20 min。取研磨上清液100 μl分别接种到生长至80%的单层BHK-21和C6/36细胞培养板中（24孔板），BHK-21和C6/36细胞分别放入37 ℃，5%CO₂和28 ℃培养箱连续培养。每12 h在显微镜下观察细胞病变（CPE），所有标本均盲传3代。出现CPE时收取病毒液保存于-80 ℃低温冰箱直至进一步鉴定^[9]。

使用RNA提取试剂盒（Viral RNA mini Kit，QIAGEN公司），根据说明书进行操作，得到的液体RNA核酸立即使用或-40 ℃保存。

将RNA立即放入65 ℃水浴10 min后，冰浴2 min，吸取32 μl的RNA放入第一链反应管（Viral RNA mini Kit）中静置1 min，加入1 μl的pd（N）6后瞬时离心使总体积为33 μl，37 ℃水浴1 h，使用或立即放入-40 ℃保存，完成cDNA的制备^[8]。

鉴定病毒使用的属特异性引物（黄病毒属、甲病毒属、布尼亚病毒属）和种特异性引物（乙脑病毒、版纳病毒、辽宁病毒、西藏环状病毒、辛德毕斯病毒、OYA病毒、盖塔病毒）来自文献[8, 10]，扩增名称、区段大小等引物信息见表 1。综合考虑扩增目的片段长度、引物退火温度等信息，以引物的最适反应条件进行病毒基因的扩增。

表 1 实验所用引物 Table 1 Primers used for virus identification

表选项

病毒基因扩增（PCR）体系25 μl，包括以cDNA为模板、GoTaq^® Green Master Mix，2×（Promega，Madison，WI）、10 μmol/L的正、反向引物。

PCR反应结束后，取5 μl PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳实验，实验结果为阳性者送北京擎科新业生物技术有限公司进一步测序。将测序结果进行BLAST〔美国国立生物技术信息中心（NCBI）〕比对，针对获得GenBank信息鉴定病毒基因的种类。

使用Seqman软件（DNAStar，Madison，WI）进行核苷酸序列拼接与质量分析；使用BioEdit（Version 7.0，Thomas）软件进行核苷酸多序列比对；使用MEGA 6.0软件完成基于Neighbour-Joining方法的系统进化分析，Bootstrap值设定为1 000；使用MegAlign进行核苷酸和氨基酸序列的同源性分析^[8]。

2017年共采集蚊虫3属3种7 380只，即中华按蚊（Anopheles sinensis）、骚扰阿蚊（Armigeres subalbatus）和三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）。其中骚扰阿蚊最多，占采集蚊虫总数的61.55%（4 542/7 380），中华按蚊占26.80%（1 978/7 380），三带喙库蚊810只，其他蚊虫50只。

采集蚊虫共研磨处理149批，研磨的上清液分别接种BHK-21和C6/36细胞，最终获得3株病毒分离物。病毒株GZDJ1765来自三带喙库蚊，病毒株GZDJ1746-1和GZDJ1752-1均来自骚扰阿蚊。

对3株病毒分离物，使用多种病毒基因属特异性和种特异性扩增引物（表 1）进行基因扩增及测序。结果显示病毒分离物GZDJ1765对黄病毒属特异PCR引物以及乙脑病毒特异PCR引物扩增呈阳性。测序结果经BLAST比对为乙脑病毒。2株病毒株GZDJ1746-1和GZDJ1752-1对盖塔病毒PCR引物扩增呈阳性，测序比对结果为盖塔病毒。

对149批蚊虫研磨液进行多种属和种特异性引物的病毒基因扩增，除病毒阳性分离物，结果显示编号GZDJ1704、GZDJ1743-2、GZDJ1751-2在乙脑病毒巢式引物PCR获得目的条带，经序列测定与BLAST比对显示为基因Ⅰ型乙脑病毒。标本未测出E基因区段。

获得病毒株GZDJ1765的E基因片段阳性目的条带，经序列测定与比对，病毒株GZDJ1765的E基因核苷酸序列为1 500 nt，氨基酸序列为500 aa。

将GZDJ1765与从GenBank中下载的35株不同年代、不同分离国家、不同宿主、不同基因型的乙脑病毒以及MVE-1-51病毒株构建E基因的系统进化树。结果显示，贵州省乙脑病毒新分离株为基因Ⅰ型，与2016年贵州省乙脑病毒分离株属于同一分支，与2008年我国台湾地区分离株TPC0806C和2015年湖南省分离株HNML1亲缘关系较近，系统进化分析见图 1。

图 1 基于流行性乙型脑炎病毒的E基因核苷酸序列为基础的系统进化分析 Figure 1 Phylogenetic analysis of JEV isolates based on E gene sequence

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比较2017年贵州省新分离株GZDJ1765与2016年3株贵州省乙脑病毒分离株的E基因序列，结果显示，4株乙脑病毒核苷酸（氨基酸）序列同源性在98.5%~99.3%（99.2%~100%）之间；病毒株GZDJ1765与基因Ⅲ型的病毒株SA14-14-2的核苷酸（氨基酸）序列比较，同源性为87.9%（97.2%）；与基因Ⅲ型P3株核苷酸（氨基酸）序列比较，同源性为88.3%（97.8%）；与2004年贵州省分离株GZ04-36的核苷酸同源性为87.8%（95.8%）。

GZDJ1746-1和GZDJ1752-1病毒的衣壳蛋白核苷酸序列为804 nt，编码氨基酸为268 aa，GZDJ1746-1和GZDJ1752-1获得E2基因序列，核苷酸序列为1 266 nt，编码氨基酸序列为422 aa。

将GZDJ1746-1和GZDJ1752-1病毒株与国内外分离到的28株盖塔病毒进行衣壳蛋白序列的系统进化分析，包括从1955-2016年日本、马来西亚、俄罗斯、韩国和中国分离的盖塔病毒株，系统进化分析显示，2017年中国贵州省分离的盖塔病毒与2002年以来中国从猪血清（GETV-V1）、三带喙库蚊（HB0234）、白纹伊蚊（Aedes albopictus，YN08）分离的盖塔病毒以及1993年从韩国牛血清中分离的盖塔病毒株（QIAG9301）属于同一进化分支，系统进化分析见图 2。

图 2 盖塔病毒新分离株Caspid基因的系统进化分析 Figure 2 Phylogenetic analysis of GETV isolates based on Caspid gene sequence

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将GZDJ1746-1和GZDJ1752-1病毒株与国内外分离到的39株盖塔病毒进行E2蛋白序列的系统进化分析，结果显示，GZDJ1746-1和GZDJ1752-1病毒株与2005年上海市分离株（SH05-15）、2008年贵州省分离株（GZ0862）、2006年甘肃省分离株（GS10-2）亲缘关系较近，系统进化分析见图 3。

图 3 盖塔病毒新分离株E2基因的系统进化分析 Figure 3 Phylogenetic analysis of GETV isolates based on E2 segment nucleotide sequence

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将2017年贵州省新分离病毒株GZDJ1746-1和GZDJ1752-1与国内外分离到的盖塔病毒（马来西亚、中国、日本、韩国、蒙古）进行衣壳蛋白序列的核苷酸与氨基酸序列同源性分析，GZDJ1746-1与GZDJ1752-1盖塔病毒株核苷酸（氨基酸）序列同源性为98.8%（99.6%）。GZDJ1746-1与马来西亚原始分离株MM2021的核苷酸（氨基酸）序列的同源性为95.4%（97.5%）。GZDJ1746-1与中国河北省分离株（HB0234）、四川省分离株（SC1210）、海南省分离株（M1）、湖南省分离株（HuN1）、云南省分离株（YN12031）的核苷酸（氨基酸）序列同源性在96.4%~99.3%（98.2~100%）之间。GZDJ1746-1与2002年河北省盖塔病毒分离株HB0234的核苷酸（氨基酸）序列同源性最高为99.3%（100%），见表 2。

表 2 盖塔病毒新分离株Caspid基因核苷酸及氨基酸同源性比较结果（%） Table 2 Sequence identities for the Capsid gene of GETV(%)

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经分析GZDJ1746-1和GZDJ1752-1病毒株之间E2蛋白核苷酸（氨基酸）序列同源性为99.3%（99.8%）；将GZDJ1746-1和GZDJ1752-1病毒株与国内外分离到的盖塔病毒进行E2蛋白序列的核苷酸与氨基酸序列同源性分析，GZDJ1746-1病毒株与马来西亚原始分离株MM2021的核苷酸（氨基酸）序列的同源性为94.5%（97.9%）；GZDJ1746-1病毒株与中国甘肃省分离的盖塔病毒株GS10-2的核苷酸（氨基酸）序列同源性最高，为99.3%（100%）。GZDJ1746-1与2008年贵州省分离的盖塔病毒株GZ0862、GZ0885核苷酸（氨基酸）序列同源性为99.1%（99.8%），见表 3。

表 3 盖塔病毒新分离株E2基因核苷酸及氨基酸同源性比较结果（%） Table 3 Sequence identities for the E2 gene of GETV(%)

表选项

贵州省属于亚热带气候，雨量较多，地形地貌复杂，非常适宜蚊虫孳生，7、8月蚊虫密度最大。2016年8月在贵州省德江县龙泉乡居池坝村、青龙镇石打头村共采集蚊虫3属4种，以中华按蚊为优势蚊种，其次是致倦库蚊。2017年8月在同一采集村庄开展虫媒病毒调查，采集蚊虫3属3种7 380只，骚扰阿蚊占采集蚊虫总数的61.55%，为优势蚊种，可能与采集点的环境有关，2017年降雨量小，不利于库蚊孳生。德江县青龙镇石打头村位于半山腰上，水源较少，居民的居住环境及卫生条件较差；牲畜以猪为主，未定期消毒、清理与灭蚊，畜养环境较差。有研究发现，骚扰阿蚊在长江以南均有分布，该蚊喜聚于弱碱性潮湿、有臭味的环境^[11]，孳生环境以厕所、牲畜粪池为主，骚扰阿蚊幼虫在人粪尿池中密度最大，而我们选择的蚊虫采集点大多以猪圈为主，因此在当地采集到较多的骚扰阿蚊。

2016年在贵州省德江县采集的蚊虫中分离到寨卡病毒、版纳病毒、乙脑病毒各2株、1株浓核病毒，这是中国首次从自然界采集的致倦库蚊和骚扰阿蚊中分离到寨卡病毒，也是首次从贵州省分离到版纳病毒^[8]。本研究2017年在同一地区，并选择8月初在贵州省德江县同一村庄采集蚊虫标本并开展病毒分离等，但采集的所有蚊虫标本均未分离到寨卡病毒，也未获得寨卡病毒基因检测阳性。寨卡病毒于1947年在乌干达恒河猴体内首次发现，2015年以来自南美洲多个国家流行，造成约200万人感染，主要通过蚊虫叮咬传播，感染寨卡病毒后会出现发热、皮疹、关节痛等临床症状以及新生儿小头畸形、成年人的格林巴利综合征^[12-13]。我国仅有输入寨卡病毒感染病例，未见本地感染病例。2016年在贵州省当地蚊虫标本中分离到寨卡病毒，但是未发现寨卡病毒感染病例，贵州省当地是否存在寨卡病毒感染病例还需进一步调查。此外，还应该在当地开展健康人群中寨卡病毒抗体调查，了解当地寨卡病毒感染状况；另需开展当地多种动物的寨卡病毒血清流行病学调查，以了解当地动物寨卡病毒感染状况以及当地是否存在寨卡病毒与动物间的自然循环等。

盖塔病毒属于披膜病毒科甲病毒属，1955年首次从马来西亚采集的蚊虫中分离到该病毒^[14]，之后在澳大利亚、日本、俄罗斯、东南亚以及中国广泛流行^[14-15]。1964年我国首次在原广东省海南市采集的库蚊中分离到盖塔病毒株M1^[16]，近年来在我国多个省份（河北、云南、上海、甘肃、山东、辽宁、河南等）蚊虫标本中分离到病毒株^[17-20]，进一步说明盖塔病毒在我国自然界大范围存在。2008年首次在贵州省分离到多株盖塔病毒^[3]，本研究在采集的骚扰阿蚊中分离到2株盖塔病毒，说明该病毒在当地长期存在。分子特征分析显示，2017年新分离病毒株与2008年贵州省分离盖塔病毒株在E2基因的氨基酸同源性高，差异较小。不仅提示骚扰阿蚊是除库蚊外盖塔病毒的主要传播媒介，也说明盖塔病毒在贵州省已经形成稳定的自然循环圈，具有潜在感染动物的可能性。

马感染盖塔病毒后主要表现为皮疹、发热以及淋巴结肿大，此前在日本、印度等地由于感染盖塔病毒引起马匹疾病的流行，造成巨大经济损失。20世纪90年代对南方11个地区进行调查，3 077份健康人血清进行盖塔病毒的中和抗体实验，阳性率为0.18%^[21]。1992年在中国海南省128份发热患者血清标本中检测抗体阳性率为10.9%，同年在海南省采集的猪、牛、羊血清中检测到盖塔病毒的中和抗体，阳性率分别为17.6%、25.0%和37.5%^[22]。2017年我国湖南省某养殖场发生盖塔病毒在猪群中的流行，200头幼猪出生后5~10 d死亡，而且150头孕猪发生死产或者死胎^[23]，提示盖塔病毒在我国动物和人体内感染。因此，应加强动物和人由盖塔病毒引起疾病感染的监测，在贵州省当地应开展血清学流行病学实验，连续进行虫媒病毒的监测，做好防蚊控蚊，切断传播途径。