中国媒介生物学及控制杂志  2018, Vol. 29 Issue (5): 425-427

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张琳, 苗广青, 侯学霞, 李博, 郝琴
ZHANG Lin, MIAO Guang-qing, HOU Xue-xia, LI Bo, HAO Qin
巢式PCR和实时荧光定量PCR在莱姆病宿主动物监测中的应用评价
Evaluation of nested PCR and real-time PCR in host surveillance of Lyme disease
中国媒介生物学及控制杂志, 2018, 29(5): 425-427
Chin J Vector Biol & Control, 2018, 29(5): 425-427
10.11853/j.issn.1003.8280.2018.05.001

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收稿日期: 2018-04-09
网络出版时间: 2018-08-03 17:12
巢式PCR和实时荧光定量PCR在莱姆病宿主动物监测中的应用评价
张琳1, 苗广青1, 侯学霞1, 李博2, 郝琴1     
1 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206;
2 新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心, 乌鲁木齐 830001
摘要: 目的 应用巢式PCR和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测啮齿动物中伯氏疏螺旋体的带菌率,对2种方法在莱姆病宿主动物监测中的应用效果进行评价。方法 2017年7-9月,在新疆维吾尔自治区(新疆)古尔图地区野外放置鼠夹,采集啮齿动物,并鉴别种类;采用巢式PCR和qRT-PCR 2种方法检测标本携带伯氏疏螺旋体情况,并对2种方法的检测结果进行统计学分析。对巢式PCR检测的阳性标本进行测序和序列比对分析,以初步确定伯氏疏螺旋体的基因型别。结果 共检测啮齿动物标本134份,巢式PCR和qRT-PCR检测阳性率分别为13.43%和12.69%,差异无统计学意义(χ2=0.000,P=1.000);阳性标本均为长尾黄鼠,总阳性率为20.15%,其中8份标本经2种方法检测结果均为阳性;10份巢式PCR检测为阳性的标本经qRT-PCR检测为阴性,9份qRT-PCR检测为阳性的标本经巢式PCR检测为阴性。采用qRT-PCR方法共检出伯氏疏螺旋体阳性17份,阳性样本Ct值为33.49~37.89。结论 2种方法均可用于啮齿动物的伯氏疏螺旋体检测,同时使用2种方法可提高伯氏疏螺旋体的检出率。巢式PCR方法检测可以了解新疆古尔图地区啮齿动物感染伯氏疏螺旋体的基因型别;而qRT-PCR方法则可对标本中的细菌载量进行定量分析。
关键词: 伯氏疏螺旋体     啮齿动物     巢式聚合酶链式反应     实时荧光定量聚合酶链式反应    
Evaluation of nested PCR and real-time PCR in host surveillance of Lyme disease
ZHANG Lin1, MIAO Guang-qing1, HOU Xue-xia1, LI Bo2, HAO Qin1     
1 State Key Laboratory of Infectious Diseases Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China;
2 Xinjiang Center for Disease Control and Prevention
Supported by the Thirteenth Major Project (No. 2017ZX10303404-006-003) and Pathogen Monitoring Ability Construction Project (No. 131031102000150003)
Corresponding author: HAO Qin, Email:haoqin@icdc.cn.
Abstract: Objective Nested PCR and quantitative real-time PCR were applied to identify the infection of Borrelia burgdorferi in rodents in this study, so that application of these two methods in host surveillance of Lyme disease can be evaluated. Methods The rodents were collected from Guertu, Xinjiang Uygur Autonomous Region during July to September in 2017. The rodents were examined for the presence of B. burgdorferi by nested PCR and real-time PCR. Results In total of 134 rodent samples, the positive rate by nested PCR was 13.43% with 18 positive samples identified, whereas 17 samples were identified positive by qRT-PCR assay and the positive rate was 12.69%. The cycle threshold(Ct) value was 33.49-37.89. There was no significant difference between the two assays (χ2=0.000, P=1.000). All the positives were detected from Spermophilus undulatus. Conclusion The results suggested that both nested PCR and real-time PCR could be used in identifying B. burgdorferi in rodents. Combination of these two assays could increase the positive rate. The results of nested PCR could provide local-predominant genotypes; however bacterial loads can be estimated by qRT-PCR assay.
Key words: Borrelia burgdorferi     Rodents     Nested PCR     Quantitative real-time PCR    

莱姆病是一种主要经蜱传播的人兽共患病,可引起人体多系统、多器官损害。其致病病原体为伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi),俗称莱姆病螺旋体。据报道,全世界现已有五大洲70多个国家存在莱姆病,且发病区域和发病率均呈扩大和上升趋势,该病已被WHO列为重点防治研究对象[1]。我国自20世纪80年代开始研究莱姆病以来,已报道29个省(自治区、直辖市)开展的血清学调查工作。被调查人群血清抗体阳性率为0.22%~44.18%,从20个省(自治区、直辖市)的病例、动物和/或蜱中分离出病原体,证实我国存在莱姆病自然疫源地,部分地区还有典型的莱姆病病例存在[2-4]。我国莱姆病疫区主要分布于东北部、西北部和华北地区,分布范围广,高危人群多。新疆维吾尔自治区(新疆)位于我国西北部,是我国莱姆病的重要疫区,存在大量莱姆病病例。新疆古尔图地区是天山灰旱獭(Marmota baibacina)-长尾黄鼠(Spermophilus undulatus)鼠疫自然疫源地的重要组成部分,已证实有多种自然疫源性、人畜共患传染病存在[5],但该地区尚未有莱姆病相关报道。通过调查该地区啮齿动物携带伯氏疏螺旋体情况,为当地莱姆病的防控提供依据。

目前,伯氏疏螺旋体带菌率的检测方法主要为PCR方法,包括普通PCR和巢式PCR。常用的靶基因有5S-23S rRNA基因间隔区、ospAfla[6-9]。巢式PCR较普通PCR敏感度和特异度高而被广泛应用。近年来,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实现了PCR由定性到定量的飞跃,其具有特异性强、灵敏度高、定量准确、速度快和全封闭反应等优点,成为分子生物学研究的重要工具[10]。2014年耿震等[11]建立了针对伯氏疏螺旋体的RT-PCR方法,用于检测标本中的伯氏疏螺旋体。本研究使用巢式PCR和qRT-PCR对标本进行检测,现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 标本采集

2017年7-9月,在新疆古尔图地区野外放置鼠夹,采集啮齿动物,并鉴别物种,随后对其解剖,收集肾及脾脏,置离心管内,于-80 ℃保存。

1.2 试剂

DNA提取试剂盒(DNeasy® Blood & Tissue Kit)购自德国Qiagen公司。巢式PCR引物由北京擎科兴业生物技术有限公司合成,qRT-PCR引物和探针由上海基康生物技术有限公司合成。PCR相关试剂由TaKaRa公司提供。

1.3 菌株来源

伯氏疏螺旋体阳性对照为我国B. garinii基因型代表菌株PD91,由中国CDC传染病预防控制所提供。将实验室保存的PD91菌株于BSKⅡ培养基中传代培养,当菌体浓度达到107~108/ml时,收集菌株,置于离心管中,以13 000×g离心30 min,弃上清液,再用0.01 mol/L pH值7.4的PBS溶液洗涤3次,弃上清液。最后加入100 μl ddH2O重悬,恒温金属浴100 ℃水煮10 min,最后5 000×g离心5 min,吸取上清液保存于-20 ℃冰箱,备用。

1.4 伯氏疏螺旋体的检测 1.4.1 DNA提取

采用Qiagen的DNA提取试剂盒,按照使用说明书,提取标本DNA 134份。

1.4.2 巢式PCR

参照文献[6-7]的rrf(5S)-rrl(23S)rRNA基因间隔区巢式PCR引物,见表 1。50 μl反应体系:2×Taq Master Mix 25 μl,正、反向引物(100 mol/L)各1 μl,第1轮模板4 μl,第2轮模板0.5 μl。反应条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性45 s,53 ℃退火45 s(第2轮退火温度为55 ℃),72 ℃延伸45 s,35个循环,72 ℃延伸5 min。巢式PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测,利用凝胶成像仪拍照。阳性片段250 bp左右。

表 1 巢式PCR与实时荧光定量PCR引物序列 Table 1 Nested-PCR primers and quantitative real-time PCR primers and probe
1.4.3 qRT-PCR引物设计

参照文献[11],选择伯氏疏螺旋体特异性基因recA作为检测靶基因。引物探针序列见表 1。20 μl反应体系:2×Taq Master Mix10 μl,正、反向引物(10 μmol/L)各0.5 μl,探针(10 μmol/L),模板4 μl,阳性对照1 μl。反应条件:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性10 s,54 ℃退火30 s,40个循环;40 ℃保存。产物检测使用荧光定量PCR系统(Roche LightCycle 480,瑞士)分析数据。

2 结果 2.1 啮齿动物带菌率

采用巢式PCR和qRT-PCR方法共检测啮齿动物标本134份,包括长尾黄鼠119份、小林姬鼠(Apodemus sylvaticus)7份、高山银䶄(Alticola roylei)2份和旱獭(Marmota baibacina)6份。巢式PCR检测阳性率为13.43%(18/134),qRT-PCR检测阳性率为12.69%(17/134),差异无统计学意义(χ2=0.000,P=1.000),阳性标本均为长尾黄鼠。啮齿动物标本总阳性率为20.15%(27/134),全部为长尾黄鼠,其他3种动物均未检测到伯氏疏螺旋体。

2.2 巢式PCR和qRT-PCR方法比较

对134份啮齿动物标本进行检测,其中8份标本经巢式PCR和qRT-PCR检测均为阳性。10份巢式PCR检测为阳性的标本经qRT-PCR检测为阴性;9份qRT-PCR检测为阳性的标本经巢式PCR检测为阴性。

rrf-rrl基因间隔区进行巢式PCR检测的18份阳性标本进行测序,并通过美国国立生物技术信息中心BLAST比对发现,9份标本与B. garinii有99%~100%相似,另9份标本与B. afzelii有99%~100%相似。采用qRT-PCR方法共检出伯氏疏螺旋体阳性17份,阳性标本的Ct值为33.49~37.89,见图 1

图 1 部分标本实时荧光定量PCR检测结果 Figure 1 Results of real-time PCR for rodent samples
3 讨论

莱姆病是一种自然疫源性疾病,广泛分布于我国大部分省(自治区、直辖市),传播病原体为伯氏疏螺旋体,其在自然界的存活依赖于宿主动物与媒介的相互传播。伯氏疏螺旋体的宿主主要为啮齿动物。在我国和欧洲,普遍认为啮齿目姬鼠属和䶄属为主要宿主。本研究发现,古尔图地区优势鼠种长尾黄鼠的带菌率达20.15%,提示长尾黄鼠可能为当地伯氏疏螺旋体的重要宿主。因样本量较小,本研究可能无法准确地显示小林姬鼠、高山银䶄和旱獭携带伯氏疏螺旋体情况,需扩大标本量进行深入调查。

对巢式PCR阳性标本rrf-rrl基因间隔区进行测序发现,有9份标本与B. garinii基因型相似,9份与B. afzelii基因型相似,提示新疆古尔图地区宿主动物感染伯氏疏螺旋体的基因型主要为B. gariniiB. afzelii型。qRT-PCR检测结果表明,长尾黄鼠阳性标本的Ct值为33.49~37.89。耿震等[11]报道,感染动物的伯氏疏螺旋体载量较低,为10~100个菌,揭示了古尔图地区虽然存在伯氏疏螺旋体感染,但带菌量较低。目前,古尔图地区尚无人感染莱姆病病例报道,但结合本结果可以发现,该地区伯氏疏螺旋体对啮齿动物的感染率较高,同时牧民、矿工等野外作业人员接触长尾黄鼠的概率极高[5]。虽然感染动物的伯氏疏螺旋体载量偏低,但综合以上各因素,揭示古尔图地区依然存在人感染莱姆病的风险,需进一步开展伯氏疏螺旋体感染人群和媒介的调查。

本研究使用巢式PCR和qRT-PCR方法检测古尔图地区啮齿动物伯氏疏螺旋体的带菌率,标本阳性率差异无统计学意义。但进一步比较发现,2种方法检测结果不同,可能因选取的靶基因、敏感性及体系中酶活性不同等[12]。本研究发现,同时使用2种方法检测不仅使结果更加全面和准确,同时可以了解该地伯氏疏螺旋体感染的基因型,并且可量化标本的细菌载量。

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