莱姆病是一种主要经蜱传播的人兽共患病，可引起人体多系统、多器官损害。其致病病原体为伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi），俗称莱姆病螺旋体。据报道，全世界现已有五大洲70多个国家存在莱姆病，且发病区域和发病率均呈扩大和上升趋势，该病已被WHO列为重点防治研究对象^[1]。我国自20世纪80年代开始研究莱姆病以来，已报道29个省（自治区、直辖市）开展的血清学调查工作。被调查人群血清抗体阳性率为0.22%~44.18%，从20个省（自治区、直辖市）的病例、动物和/或蜱中分离出病原体，证实我国存在莱姆病自然疫源地，部分地区还有典型的莱姆病病例存在^[2-4]。我国莱姆病疫区主要分布于东北部、西北部和华北地区，分布范围广，高危人群多。新疆维吾尔自治区（新疆）位于我国西北部，是我国莱姆病的重要疫区，存在大量莱姆病病例。新疆古尔图地区是天山灰旱獭（Marmota baibacina）-长尾黄鼠（Spermophilus undulatus）鼠疫自然疫源地的重要组成部分，已证实有多种自然疫源性、人畜共患传染病存在^[5]，但该地区尚未有莱姆病相关报道。通过调查该地区啮齿动物携带伯氏疏螺旋体情况，为当地莱姆病的防控提供依据。

目前，伯氏疏螺旋体带菌率的检测方法主要为PCR方法，包括普通PCR和巢式PCR。常用的靶基因有5S-23S rRNA基因间隔区、ospA和fla等^[6-9]。巢式PCR较普通PCR敏感度和特异度高而被广泛应用。近年来，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实现了PCR由定性到定量的飞跃，其具有特异性强、灵敏度高、定量准确、速度快和全封闭反应等优点，成为分子生物学研究的重要工具^[10]。2014年耿震等^[11]建立了针对伯氏疏螺旋体的RT-PCR方法，用于检测标本中的伯氏疏螺旋体。本研究使用巢式PCR和qRT-PCR对标本进行检测，现将结果报告如下。

2017年7-9月，在新疆古尔图地区野外放置鼠夹，采集啮齿动物，并鉴别物种，随后对其解剖，收集肾及脾脏，置离心管内，于-80 ℃保存。

DNA提取试剂盒（DNeasy^® Blood & Tissue Kit）购自德国Qiagen公司。巢式PCR引物由北京擎科兴业生物技术有限公司合成，qRT-PCR引物和探针由上海基康生物技术有限公司合成。PCR相关试剂由TaKaRa公司提供。

伯氏疏螺旋体阳性对照为我国B. garinii基因型代表菌株PD91，由中国CDC传染病预防控制所提供。将实验室保存的PD91菌株于BSKⅡ培养基中传代培养，当菌体浓度达到10⁷~10⁸/ml时，收集菌株，置于离心管中，以13 000×g离心30 min，弃上清液，再用0.01 mol/L pH值7.4的PBS溶液洗涤3次，弃上清液。最后加入100 μl ddH₂O重悬，恒温金属浴100 ℃水煮10 min，最后5 000×g离心5 min，吸取上清液保存于-20 ℃冰箱，备用。

采用Qiagen的DNA提取试剂盒，按照使用说明书，提取标本DNA 134份。

参照文献[6-7]的rrf（5S）-rrl（23S）rRNA基因间隔区巢式PCR引物，见表 1。50 μl反应体系：2×Taq Master Mix 25 μl，正、反向引物（100 mol/L）各1 μl，第1轮模板4 μl，第2轮模板0.5 μl。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s（第2轮退火温度为55 ℃），72 ℃延伸45 s，35个循环，72 ℃延伸5 min。巢式PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，利用凝胶成像仪拍照。阳性片段250 bp左右。

表 1 巢式PCR与实时荧光定量PCR引物序列 Table 1 Nested-PCR primers and quantitative real-time PCR primers and probe

表选项

参照文献[11]，选择伯氏疏螺旋体特异性基因recA作为检测靶基因。引物探针序列见表 1。20 μl反应体系：2×Taq Master Mix10 μl，正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μl，探针（10 μmol/L），模板4 μl，阳性对照1 μl。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性10 s，54 ℃退火30 s，40个循环；40 ℃保存。产物检测使用荧光定量PCR系统（Roche LightCycle 480，瑞士）分析数据。

采用巢式PCR和qRT-PCR方法共检测啮齿动物标本134份，包括长尾黄鼠119份、小林姬鼠（Apodemus sylvaticus）7份、高山银䶄（Alticola roylei）2份和旱獭（Marmota baibacina）6份。巢式PCR检测阳性率为13.43%（18/134），qRT-PCR检测阳性率为12.69%（17/134），差异无统计学意义（χ²=0.000，P=1.000），阳性标本均为长尾黄鼠。啮齿动物标本总阳性率为20.15%（27/134），全部为长尾黄鼠，其他3种动物均未检测到伯氏疏螺旋体。

对134份啮齿动物标本进行检测，其中8份标本经巢式PCR和qRT-PCR检测均为阳性。10份巢式PCR检测为阳性的标本经qRT-PCR检测为阴性；9份qRT-PCR检测为阳性的标本经巢式PCR检测为阴性。

对rrf-rrl基因间隔区进行巢式PCR检测的18份阳性标本进行测序，并通过美国国立生物技术信息中心BLAST比对发现，9份标本与B. garinii有99%~100%相似，另9份标本与B. afzelii有99%~100%相似。采用qRT-PCR方法共检出伯氏疏螺旋体阳性17份，阳性标本的Ct值为33.49~37.89，见图 1。

图 1 部分标本实时荧光定量PCR检测结果 Figure 1 Results of real-time PCR for rodent samples

图选项

莱姆病是一种自然疫源性疾病，广泛分布于我国大部分省（自治区、直辖市），传播病原体为伯氏疏螺旋体，其在自然界的存活依赖于宿主动物与媒介的相互传播。伯氏疏螺旋体的宿主主要为啮齿动物。在我国和欧洲，普遍认为啮齿目姬鼠属和䶄属为主要宿主。本研究发现，古尔图地区优势鼠种长尾黄鼠的带菌率达20.15%，提示长尾黄鼠可能为当地伯氏疏螺旋体的重要宿主。因样本量较小，本研究可能无法准确地显示小林姬鼠、高山银䶄和旱獭携带伯氏疏螺旋体情况，需扩大标本量进行深入调查。

对巢式PCR阳性标本rrf-rrl基因间隔区进行测序发现，有9份标本与B. garinii基因型相似，9份与B. afzelii基因型相似，提示新疆古尔图地区宿主动物感染伯氏疏螺旋体的基因型主要为B. garinii和B. afzelii型。qRT-PCR检测结果表明，长尾黄鼠阳性标本的Ct值为33.49~37.89。耿震等^[11]报道，感染动物的伯氏疏螺旋体载量较低，为10~100个菌，揭示了古尔图地区虽然存在伯氏疏螺旋体感染，但带菌量较低。目前，古尔图地区尚无人感染莱姆病病例报道，但结合本结果可以发现，该地区伯氏疏螺旋体对啮齿动物的感染率较高，同时牧民、矿工等野外作业人员接触长尾黄鼠的概率极高^[5]。虽然感染动物的伯氏疏螺旋体载量偏低，但综合以上各因素，揭示古尔图地区依然存在人感染莱姆病的风险，需进一步开展伯氏疏螺旋体感染人群和媒介的调查。

本研究使用巢式PCR和qRT-PCR方法检测古尔图地区啮齿动物伯氏疏螺旋体的带菌率，标本阳性率差异无统计学意义。但进一步比较发现，2种方法检测结果不同，可能因选取的靶基因、敏感性及体系中酶活性不同等^[12]。本研究发现，同时使用2种方法检测不仅使结果更加全面和准确，同时可以了解该地伯氏疏螺旋体感染的基因型，并且可量化标本的细菌载量。