东北地区蜱传斑点热群立克次体的分子流行病学研究
  中国媒介生物学及控制杂志  2018, Vol. 29 Issue (4): 344-347

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王卓, 王建伟, 于淼, 邢悦鹏, 冯立, 杨义军, 王秀红, 田圃, 吴益民
WANG Zhuo, WANG Jian-wei, YU Miao, XING Yue-peng, FENG Li, YANG Yi-jun, WANG Xiu-hong, TIAN Pu, WU Yi-min
东北地区蜱传斑点热群立克次体的分子流行病学研究
Molecular epidemiological studies on spotted fever group rickettsia in ticks from Northeastern China
中国媒介生物学及控制杂志, 2018, 29(4): 344-347
Chin J Vector Biol & Control, 2018, 29(4): 344-347
10.11853/j.issn.1003.8280.2018.04.005

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收稿日期: 2018-02-24
网络出版时间: 2018-06-01 11:52
东北地区蜱传斑点热群立克次体的分子流行病学研究
王卓1, 王建伟2, 于淼1, 邢悦鹏3, 冯立1, 杨义军1, 王秀红1, 田圃2, 吴益民1     
1 沈阳军区疾病预防控制中心, 沈阳 110034;
2 吉林大学生命科学学院, 长春 130012;
3 辽宁省食品检验检测院, 沈阳 110016
摘要: 目的 调查东北地区蜱感染斑点热群立克次体(SFGR)情况及其种型分布。方法 2012-2014年5-6月,采用人工布旗法在东北3省9个市(县)和黑瞎子岛不同生境采集游离蜱以及家畜(牛、羊)体表寄生吸血蜱并鉴定;采用PCR方法对蜱种进行检测,对检出的阳性样本进行测序和序列分析,并建立分子系统进化树。结果 蜱的SFGR阳性率为11.43%,不同地区SFGR阳性率差异无统计学意义(χ2=7.683,P=0.566);不同蜱种SFGR感染率差异亦无统计学意义(χ2=6.354,P=0.174)。5份嗜群血蜱标本及1份日本血蜱标本、1份森林革蜱标本与Rickettsia heilongjiangensis 054株(AF179362.2)和HL-93株(AF179364.1)聚为一支,同源性为99.30%~100%;3份长角血蜱标本与Candidatus R. hebeiii(QHD-3.HQ651817.1、TS-1.HQ651818.1、QHD-1.HQ651815.1)聚为一支,同源性为99.83%~100%;4份森林革蜱标本与R.sp.DnS14(AF009130.2)和吉林株R.sp.JL-02(AY093696.1)聚为一支,同源性为98.79%~100%。结论 东北地区蜱类SFGR感染普遍,存在感染SFGR蜱种的多样性和SFGR基因型多样性特点,提示该地区人群应重视对蜱传斑点热的防护,同时应加强患者症状的鉴别与诊断能力。
关键词:      斑点热群立克次体     聚合酶链式反应     序列分析    
Molecular epidemiological studies on spotted fever group rickettsia in ticks from Northeastern China
WANG Zhuo1, WANG Jian-wei2, YU Miao1, XING Yue-peng3, FENG Li1, YANG Yi-jun1, WANG Xiu-hong1, TIAN Pu2, WU Yi-min1     
1 Center of Disease Prevent and Control of Shenyang Command, Shenyang 110034, Liaoning Province, China;
2 Jilin University, College Life Science;
3 Liaoning Institute for Food Control
Supported by the National Science and Technology Major Project of China(No. 2016ZX10004203-001-009)and PLA Project of Applied Basic Research(No. AWS11L009)
Corresponding author: WANG Xiu-hong, E-mail:15309889377m0@sina.cn; TIAN Pu, E-mail:tianpu@jlu.edu.cn.
Abstract: Objective To investigate the prevalence and diversity of spotted fever group rickettsia infection(SFGR) in ticks in northeastern China. Methods Flagging for free-living ticks and off-host(cattle and sheep) collection for parasitic ticks were conducted from 9 counties and Heixiazi Island from Northeastern China, during May to June, 2012-2014. Conventional PCR was carried out using universal SFGR primers targeting ompA genes to screen for their infection with SFG rickettsia organisms in ticks collected. The positive products were sequenced, and molecular phylogenetic tree was established. Results The presence of SFGR was 32 of 280 pools(1 224 ticks) tested, with overall positive rate 11.43%. There were no significant differences in different regions(χ2=7.683, P=0.566) and in different tick species(χ2=6.354, P=0.174) for their infection with SFGR rickettsia. The phylogenetic analysis based on nucleotide sequence showed that 14 SFGR DNA sequences belonged to 3 SFGR species:5 samples from Dermacentor silvarum, 1 from each of Haemaphysalis concinna and H. japonica were clustered together with Rickettsia heilongjiangensis 054(AF179362.2) and HL-93(AF179364.1), showing 99.30%-100% identity; 3 samples from H. longicornis were clustered with Candidatus R. hebeiii(QHD-3.HQ651817.1, TS-1.HQ651818.1, QHD-1.HQ651815.1) with 99.83%-100% homogeny; 4 samples from D. silvarum were clustered together with R. sp. DnS14(AF009130.2), and Jilin Strain R. sp. JL-02(AY093696.1) with 98.79%-100% identity. Conclusion The prevalence of SFGR in ticks from Northeastern China was high. There was high diversity in SFG rickettsia species and tick species in the areas surveyed.
Key words: Ticks     Spotted fever group rickettsia     Polymerase chain reaction     Sequence analysis    

斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia,SFGR)属于立克次体目(Rickettsiales)、立克次体科(Rickettsiaceae)、立克次体属(Rickettsia),是一类原核生物型、短小棒状或球形状、革兰阴性专性细胞内繁殖的微生物[1]。由SFGR引起的一类疾病主要为经蜱(螨、蚤)传播的人兽共患自然疫源性疾病,分布于世界各地。近年来,世界范围内新发及再发蜱媒立克次体病逐年增多,并不断发现证实SFGR的新种或新基因型,使其增加至30余种。目前,已证实16种SFGR对人体有致病性,其中7种为新发现的立克次体,近20种立克次体的致病性尚不清楚,因此,蜱媒立克次体病面临新挑战[1-2]。我国自1962年在黑龙江省虎饶地区的东方田鼠(Microtus fortis)分离出西伯利亚立克次体(R. sibirica)(HL-84株)以来,特别是1980年后的研究表明,我国南北方地区普遍存在SFGR。对蜱、宿主动物的调查研究发现,我国SFGR存在8种(基因型),如黑龙江立克次体(R. heilongjiangensis)、西伯利亚立克次体(R. sibirica)、内蒙古立克次体(R. mongolotimona)、拉欧蒂立克次体(R. raoultii)等[3]。其中黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体、拉欧蒂立克次体和塔拉塞维奇立克次体(Candidatus R. tarasevichiae)已有实验室确诊病例报道[4-8]。随着发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)、无形体等新病原体的发现与证实,我国蜱媒传染病逐步成为公共卫生的新威胁[3, 9-10]

蜱在SFGR传播中有媒介和储存宿主的双重作用,即通过叮咬哺乳动物形成水平传播,同时又可经卵传递至子代,进行垂直传播,维持立克次体在体内的延续及自然界的循环[1]。因此,蜱类立克次体感染的监测对蜱媒立克次体病自然疫源地的确定和疾病预防及评估均有现实意义。为了解东北地区蜱类SFGR感染情况及其种型分布,我们于2012—2014年在东北3省部分地区采集蜱类,应用PCR进行SFGR的分子流行病学研究。

1 材料与方法 1.1 蜱标本来源

2012—2014年5—6月,采用人工布旗法在东北3省9个市(县)和黑瞎子岛的针阔混交林及灌木丛、草地等不同生境采集游离蜱及家畜(牛、羊)体表寄生吸血蜱,形态学鉴定分种后浸渍于75%乙醇保存。

1.2 DNA制备

蜱标本用0.9%氯化钠溶液水洗3次,滤纸吸干。根椐采集地点和蜱种进行分组,游离蜱每组4~5只,寄生吸血蜱每组2只。用玻璃研磨器将蜱研碎,应用DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN)按说明书操作提取DNA,DNA提取液置-20 ℃保存备用。

1.3 引物设计与PCR扩增

SFGR以外膜蛋白A基因(ompA)按文献[1]设计引物和PCR扩增。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列:Rr190.70p 5′-ATG GCG AAT ATT TCT CCA AAA-3′和Rr190.701n 5′-GTT CCG TTA ATG GCA GCA TCT-3′。扩增产物目的片段为632 bp。

1.4 序列测定及分子遗传进化分析

PCR阳性产物由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。应用测序结果与GenBank中BLAST序列比较,采用DNAStar及MEGA 5.0软件进行同源性分析和构建分子系统进化树。

1.5 统计学处理

利用SPSS 20.0软件进行统计学分析,率的比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 不同地区蜱的SFGR PCR检测

共采集蜱1 224只,分为280组,PCR检测具有SFGR阳性DNA片段(532 bp)有32组,阳性率为11.43%,见表 1。各地SFGR阳性率差异无统计学意义(χ2=7.683,P=0.566),说明调查地区的蜱类普遍感染SFGR。根据调查地区进行地域划分,沿黑龙江流域调查区(黑河、抚远市、逊克、萝北县和黑瞎子岛)和沿长白山山脉调查区(密山、敦化、集安、本溪市和宽甸县)蜱类SFGR阳性率分别为15.63%和9.24%,差异亦无统计学意义(χ2=1.201,P=0.273)。

表 1 东北3省不同地区蜱的斑点热立克次体PCR检测结果 Table 1 PCR analysis for spotted fever group rickettsia in ticks from different regions in northeastern, China
2.2 不同蜱种SFGR PCR检测

采集蜱分别为嗜群血蜱(Haemaphysalis concinna)、日本血蜱(H. japonica)、长角血蜱(H. loniconis)、森林革蜱(Dermacentor silvarum)和全沟硬蜱(Ixodes persulcatus)。SFGR阳性率分别为15.89%、5.26%、10.39%、12.50%和2.70%(表 2),SFGR感染率差异无统计学意义(χ2=6.354,P=0.174)。

表 2 东北3省不同蜱种斑点热群立克次体PCR检测结果 Table 2 PCR analysis for spotted fever group rickettsia in different ticks species from northeastern, China
2.3 序列测定及遗传进化分析

对32份蜱SFGR阳性标本进行测序,将成功测序的14份DNA标本和GenBank中注册的SFGR ompA基因序列进行同源性比较,并构建系统进化树。基于ompA基因的遗传进化分析显示,14份SFGR DNA标本分属于3种,5份嗜群血蜱标本(FY3、HXZ1、MS55、MS54、LB60)、日本血蜱标本(MS50)和森林革蜱标本(LB58)与R. heilongjiangensis 054株(AF179362.2)、HL-93株(AF179364.1)聚为一支,同源性为99.30%~100%;长角血蜱标本SFGR(BH36、BH43、KD9)与Candidatus R. hebeiii(QHD-3.HQ651817.1、TS-1.HQ651818.1、QHD-1.HQ651815.1)聚为一支,同源性为99.83%~100%,与R. heilongjiangensis(AF179362.2)和R. japonica(U43795.1)同源性较近;4份森林革蜱标本(X4、X10、XK36、XK40)与拉欧蒂立克次体俄罗斯株R.sp.DnS14(AH009130.2)、吉林株R.sp.JL-02(AY093696.1)聚为一支,同源性为98.79%~100%,与R. massiliae Mtu1.(U43799.1)同聚一支,见图 1。系统进化树表明,本次检测的14份测序标本分别属于斑点热群黑龙江立克次体、拉欧蒂立克次体及河北立克次体(Candidatus R. hebeiii),各蜱种的SFGR基因型分布见表 3

图 1 斑点热群立克次体ompA基因系统进化树 Figure 1 Phylogenetic tree based on spotted fever group rickettsia ompA gene
表 3 东北3省不同蜱种斑点热群立克次体基因型分布 Table 3 Distribution of spotted fever group rickettsia species in ticks
3 讨论

本研究发现,调查地区蜱类SFGR感染普遍。嗜群血蜱、日本血蜱、长角血蜱、森林革蜱和全沟硬蜱是东北地区的优势蜱种,调查地区多个蜱种均可能是SFGR的传播媒介,但血蜱属、革蜱属为SFGR感染的主要蜱种。我国存在8种SFGR(或基因型),涉及5属16个蜱种[3]。东北地区报告存在4种SFGR即黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体、拉欧蒂立克次体和塔拉塞维奇立克次体[5-8]。本调查地区从蜱中检出3种SFGR,分别为黑龙江立克次体、拉欧蒂立克次体和河北立克次体。黑龙江立克次体是由我国黑龙江省绥芬河地区森林革蜱和嗜群血蜱分离而命名,为远东蜱传斑点热的病原体[11-12],主要分布于我国东北地区和俄罗斯远东地区,日本、泰国也有报道[5, 11-13]。近年来,内蒙古自治区(内蒙古)、青海、浙江、广东、河南、安徽及河北省相继报道,从革蜱属、血蜱属、扇头蜱属(Rhipicephalus)、璃眼蜱属(Hyalomma)等检测出黑龙江立克次体[14-16]。本研究从革蜱属和血蜱属的3个蜱种中均检测到该病原体,表明该立克次体具有分布广泛和感染蜱种多样性的特点,应引起重视。而感染SFGR的蜱种不同及检出SFGR种型有所差异,可能是各地地理生态环境、蜱种分布及捕蜱季节不同导致。

本研究在逊克地区的森林革蜱中检出拉欧蒂立克次体,在辽宁省本溪市和宽甸县的长角血蜱中检测到河北立克次体,这2种SFGR是近年来发现的斑点热群新基因型。拉欧蒂立克次体最早于1999年在俄罗斯的草原革蜱(Dermacentor nuttalli)和短小扇头蜱(Rh. pumilio)中发现[17]。我国于2011年首次在新疆维吾尔自治区的森林革蜱中检测到[18]。目前,国内从西藏、内蒙古自治区和吉林省的革蜱属和血蜱属5个蜱种中检测到拉欧蒂立克次体[3, 19]。本调查发现,黑龙江省逊克地区的森林革蜱存在拉欧蒂立克次体感染,证明我国拉欧蒂立克次体主要分布于北方地区,主要由革蜱属携带传播。河北立克次体为2011年在河北省燕山山区长角血蜱首次发现,经测序与系统发育分析认为是SFGR的新基因型[20]。河北省西部和南部山区长角血蜱中河北立克次体的感染率为6.90%~7.42%[21]。本研究在辽宁省东部山区长角血蜱中检出河北立克次体,感染率为10.39%。河北省南部燕山山区、西部太行山中段南麓、本溪市和宽甸县属长白山余脉,均为低山丘陵,有相似的地理地貌和生态环境,说明河北立克次体在长角血蜱中具有相对稳定性。目前,仅从河北省[20-21]和辽宁省长角血蜱中检出河北立克次体,其他蜱种是否感染及对人体的致病性有待深入调查研究。

根据已有报道和本研究结果,东北地区SFGR存在5个种或基因型(R. heilongjiangensisR. sibiricaR. raoultiiCandidatus R. tarasevichiaeCandidatus R. hebeiii),主要涉及蜱的3属5种,揭示该地区SFGR感染具有SFGR基因型多样性、感染蜱种多样性及地域分布广泛性的特点。我国SFGR患者主要症状为发热、头痛、乏力、皮疹、焦痂、局部淋巴结肿大等[5],该病一般为自限性,但不同种或基因型SFGR感染的临床症状不同,有的可能出现重症临床表现,发生严重的多器官功能障碍或脑膜炎症状[7-8]。根据东北地区SFGR特点,应做好SFGR的预防和治疗,重点落实个人防蜱叮咬措施及蜱传立克次体病的诊断与鉴别。

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