上海口岸1只进境犬携带蜱的种类鉴定与溯源分析
  中国媒介生物学及控制杂志  2018, Vol. 29 Issue (4): 340-343

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王强, 何宇平, 吴成云, 王巧全, 王艳, 林颖峥, 陈志飞, 张强, 邓耀华, 张冠楠, 曹宇凡, 唐智芳, 李树清
WANG Qiang, HE Yu-ping, WU Cheng-yun, WANG Qiao-quan, WANG Yan, LIN Ying-zheng, CHEN Zhi-fei, ZHANG Qiang, DENG Yao-hua, ZHANG Guan-nan, CAO Yu-fan, TANG Zhi-fang, LI Shu-qing
上海口岸1只进境犬携带蜱的种类鉴定与溯源分析
Identification and traceability of an intercepted tick from imported dog at Shanghai port
中国媒介生物学及控制杂志, 2018, 29(4): 340-343
Chin J Vector Biol & Control, 2018, 29(4): 340-343
10.11853/j.issn.1003.8280.2018.04.004

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收稿日期: 2018-02-24
网络出版时间: 2018-06-01 11:52
上海口岸1只进境犬携带蜱的种类鉴定与溯源分析
王强, 何宇平, 吴成云, 王巧全, 王艳, 林颖峥, 陈志飞, 张强, 邓耀华, 张冠楠, 曹宇凡, 唐智芳, 李树清     
上海出入境检验检疫局, 上海 200135
摘要: 目的 对上海口岸截获的德国成犬体表蜱进行种类鉴定及溯源分析。方法 2016年11月28日在上海口岸进口的69只德国警犬中的第33号警犬右前肢内侧检获蜱1只,对其进行形态学鉴定,并提取其DNA,扩增线粒体16S rRNA基因进行测序、比对,并对感染途径进行溯源分析。结果 形态学鉴定该蜱符合血蜱属的形态特征,分子鉴定表明该蜱的线粒体基因序列与广泛分布于古北区和东洋区的褐黄血蜱(Haemaphysalis flava Neumann,1897)线粒体基因匹配度达98%。结论 截获蜱为褐黄血蜱,为犬入境后感染。
关键词: 分子鉴定     褐黄血蜱     上海口岸    
Identification and traceability of an intercepted tick from imported dog at Shanghai port
WANG Qiang, HE Yu-ping, WU Cheng-yun, WANG Qiao-quan, WANG Yan, LIN Ying-zheng, CHEN Zhi-fei, ZHANG Qiang, DENG Yao-hua, ZHANG Guan-nan, CAO Yu-fan, TANG Zhi-fang, LI Shu-qing     
Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China
Supported by the National Key Research and Development Program of China(No. 2016YFC1202000, 2016YFC1202004)
Corresponding author: LI Shu-qing, E-mail:lisq@shciq.gov.cn.
Abstract: Objective To identify the unknown species of ticks carried by the dog imported from Germany to China. Methods Use morphological identification, and extract the genomic DNA from the ticks, amplify the mitochondrial 16S rRNA sequences and sequencing. Blast in the NCBI, to identify the species of the ticks collected from Shanghai port on November 28, 2016. Results Morphological analysis revealed that the tick was in accordance with the morphological characteristics of Haemaphysalis. The sequence analysis results showed that the measured gene of this tick was 98% identical to the mitochondrial gene sequence of Ha. flava Neumann, 1897 which was widely distributed in Palaearctic and Oriental region. Conclusion This tick is Ha. flava, and infected the dog after entry.
Key words: Molecular identification     Haemaphysalis flava     Shanghai port    

蜱是一类专性暂时性寄生于陆生脊椎动物营体外寄生的节肢动物[1],在世界各地广泛分布,宿主种类多样,包括哺乳动物、鸟类、爬行动物及部分两栖动物等。据报道,世界上有895种蜱,其中软蜱科189种、硬蜱科705种和纳蜱科1种[2]。目前,我国发现硬蜱和软蜱两大类,共10属119种,约占世界蜱类总数的13%[3]。蜱可通过叮咬或直接接触传播多种病原体,引起森林脑炎、Q热、莱姆病和人粒细胞无形体病等多种疾病,是威胁人和动物健康的重要病媒生物[4-7]。蜱可通过动物迁徙、人员流动、货物运输等多种载体在世界范围广泛扩散[8]。目前,已知约90种蜱可作为病原体的传播媒介[9]。因此,对蜱类的准确鉴定可为蜱传疾病的风险做出科学预警和评估。病媒生物鉴定多以形态鉴定为主,自DNA条形码(DNA barcode)概念提出后[10],利用分子生物学方法进行物种鉴定有效地克服了传统形态分类鉴定过程中的诸多限制性因素,如样本的完整性、生活史周期、鉴定人员的经验及外来物种资料储备等,DNA条形码成为传统形态鉴定的有力佐证而被广泛应用[11-14]

2016年11月,上海口岸进口德国警犬69只,在隔离检疫期间,检疫人员对犬进行临床检查,从中截获蜱1只,对其进行形态和分子鉴定,并对感染途径进行了溯源分析。

1 材料与方法 1.1 材料

2016年11月23日上海口岸进口69只德国警犬,并在上海检验检疫机构指定的隔离场进行为期30 d的隔离检疫。11月28日检疫人员对警犬进行临床检查,在第33号警犬右前肢内侧检获蜱1只。

1.2 方法 1.2.1 形态鉴定

将蜱自犬皮肤上完整取出置于95%乙醇中处死,使用显微镜(ZEISS Discover.V20)进行形态学鉴定,并对鉴别特征进行拍照,后置于装有95%乙醇的1.5 ml离心管中保存。

1.2.2 DNA提取

在解剖镜下取蜱的左侧后足,放入1.5 ml离心管中,加入液氮研磨,用QiagenDNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒(Qiagen,德国)提取样品DNA。

1.2.3 PCR扩增

以提取的蜱基因组DNA为模板,以正向引物5′-CTG CTC AAT GAT TTT TTA AAT TGC TGT GG-3′,反向引物5′-CCG GTC TGA ACT CAG ATC AAG T-3′〔生工生物工程(上海)股份有限公司合成〕对线粒体16S rRNA进行扩增[15-16],扩增条件:94 ℃预变性7 min,94 ℃变性30 s,45 ℃复性60 s,72 ℃延伸60 s,40个循环,72 ℃延伸8 min[16]。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,通过凝胶成像系统进行拍照分析,并将目的基因片段送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.4 测序结果比对

将测序结果在美国国立生物技术信息中心(NCBI)进行比对以确定该蜱的种类。

1.2.5 溯源分析

根据该蜱的截获信息,结合对该批警犬的隔离检疫场所调查研判,对其来源地进行分析,并细化针对入境动物的检验检疫要求。

2 结果 2.1 形态学特征

该蜱为饥饿雄蜱,体长2 724 μm,体宽1 643 μm;肛沟围绕在肛门后;体浅黄色,背板颜色单一,无色斑;无缘褶;眼付缺,缘垛明显,有11个;足转节背面有背距;假头基矩形,中部略凹陷;须肢楔形,前端收窄,后侧角超出须肢侧缘;须肢第2节外侧缘直而短,内侧缘具针状刚毛4根,排列稀疏,基部后缘外侧具角突,末端钝,须肢第3节前端稍平钝,后缘平滑无距;口下板长度短于须肢,前端具密集小齿;齿式6/6;生殖区位于基节Ⅱ前中部之间水平;气门板较小,近似圆角三角形;足粗壮,基节Ⅰ内距粗大,锥形,基节Ⅳ内距长锥形,长度约等于该节长度,末端尖细;各足爪垫均较长,钟形(图 12)。符合血蜱属(Haemaphysalis)的形态特征[17]图 3)。

图 1 上海口岸截获蜱样本 Figure 1 Body of the intercepted tick
注:A.须肢;B.齿式(6/6);C.足基节Ⅰ~Ⅳ;D.腹部;1.生殖孔;2.气门板;3.肛门;4.肛沟 图 2 上海口岸截获蜱形态鉴别特征 Figure 2 Morphological characters of the intercepted tick
注:A.躯体背面观;B.假头背面观;C.假头腹面观;D.气门板;E.足基节Ⅰ~Ⅳ;F.跗节Ⅰ和Ⅳ 图 3 血蜱特征(仿段炜,2013) Figure 3 Morphological characters of Haemaphysalis
2.2 PCR扩增结果

对线粒体16S rRNA进行PCR扩增,经凝胶电泳检测得到与目的片段大小一致的条带(420~450 bp),见图 4

注:M. DNA Marker;1.截获蜱的线粒体16S rRNA扩增条带;2.阴性对照 图 4 PCR凝胶电泳检测结果 Figure 4 Electrophoresis results of the PCR products
2.3 序列测定与分析

将全长428 bp的PCR产物测序后在NCBI数据库中进行同源性比对,比对结果与褐黄血蜱(Haemaphysalis flava Neumann,1897)线粒体16S rRNA基因片段匹配度达98%[18],见图 5

图 5 褐黄血蜱线粒体基因序列(Sbjct)与截获蜱PCR扩增产物(Query)的比对结果 Figure 5 The 16S rRNA sequences blasted between Haemaphysalis flava (Sbjct) and the intercepted tick (Query)
3 讨论

根据《中华人民共和国进出境动植物检疫法》及《中华人民共和国进出境动植物检疫法实施条例》等有关规定,进口活体动物必须进行隔离检疫,经检疫合格放行。隔离期间需要根据检疫要求对动物进行相关传染病、寄生虫病(包括体外寄生虫)检疫。蜱是重要的动物体外寄生虫,其大量吸取动物血液,引起动物贫血,且传播多种病原体。自2010年发热伴血小板减少综合征引起人类死亡,蜱传疾病的危害越来越受重视。蜱可传播83种病毒、14种细菌、20种立克次体、18种螺旋体、32种原虫、2种线虫及衣原体、支原体、巴尔通体各1种[5]。其中大多数为人畜共患病,给公共卫生安全带来极大挑战和危害。近年来,不断有蜱通过候鸟、野生动物、劳务输出人员、口岸进口动物和货物带入国内的相关报道[8],因此,对进口动物实施严格的体表蜱检疫与鉴定有重要意义。

本研究基于形态学鉴定及基因分析结果,明确该蜱为褐黄血蜱,其可寄生于犬、猪、猪獾、黄牛、马、绵羊、野兔等哺乳动物,在锦鸡体表也曾发现,是野兔热、莱姆病等的传播媒介[19]。褐黄血蜱在我国主要分布于吉林、山东、甘肃、湖北、江苏、四川、云南、广东、广西、海南和上海等地[19-20]。国外主要分布于俄罗斯、朝鲜、日本、印度、越南和斯里兰卡[9]。该截获蜱呈饿血状态,且显微镜下可见其假头中含有动物组织,推断其感染犬的时间不长,且褐黄血蜱在上海市广泛分布而在德国暂无分布记录[20-21]。另外,警犬在隔离期间每天均需在犬舍外草坪运动场活动,而隔离舍周围布满草坪,故推断进口警犬为隔离期间感染。工作人员发现其感染后,对该批警犬进行两次驱虫预防处理,并使用除虫菊酯类杀虫剂对隔离场内的草坪运动场及其周围进行除虫处理。在隔离检疫期间,未再发现蜱和其他寄生虫。

蜱是重要的病原体传播媒介,因此,应加强进口动物体表蜱的检疫和鉴定。根据相关规定,动物进口前应在出口国隔离检疫期间驱除其体内外的寄生虫,经检疫合格的动物携带寄生虫的风险不大,但装卸、运输途中可能感染。因此,动物到达入境口岸后应及时对其体表蜱等寄生虫进行检验检疫,防止有害媒介生物传入。另外,在动物进入隔离场前,对隔离场及周围环境除使用消毒药物处理外,还应使用高效、低毒杀虫药物采取除虫措施,防止蜱等病媒生物叮咬动物,传播疾病。

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