鼠类的分类鉴定是鼠害研究的重要内容，目前大多数研究以形态学特征为基础，如外形特征、头骨特征和牙齿特征等^[1]。形态学鉴定要求标本具备比较典型的外部形态特征，同时鉴定人员需具备丰富的鉴定经验，实际工作中往往影响鉴定结果的准确性。DNA条形码（DNA barcoding）是近年来发展较快的一项分子鉴定新技术，是通过对标准目的基因DNA序列进行分析快速鉴定物种的技术^[2]。与传统依赖形态进行鉴定的方法比较，DNA条形码不受生物性别、发育阶段、性状相似性和表型可塑性的限制和影响，且对鉴定人员的专业分类知识要求不高，因而迅速成为动物生态学和动物流行病学调查研究的有用工具^[3-5]。

DNA条形码由Hebert等^[6]于2003年首次提出，并提出将一段长648 bp的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因作为动物鉴定的通用条形码序列。线粒体DNA基因重组率低，同时进化速率较快，是进行遗传进化和种群分析研究的良好材料^[7]。Robins等^[8]、Tamrin和Abdullah^[9]先后采用COⅠ基因进行鼠种鉴定。此外，DNA条形码还在国内一些地区的鼠形动物分类和鉴定中得以应用，均证实了DNA条形码技术是一种可行的鼠类鉴定方法^[10-12]。

以2016年在广东省阳春市捕获的2只鼠样本为研究对象，因其形态差异较大，且1只头骨被鼠夹破坏，因此，分别取少许肝脏保存于无水乙醇中，放置4 ℃冰箱备用。

DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、DNA Marker、上样缓冲液和Gold View核酸染料均购自TaKaRa公司，其他试剂均为国产分析纯。

取鼠肝脏约25 mg，按照DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。

通用引物BatL5310：5′-CCT ACT CRG CCA TTT TAC CTA TG-3′和R6036R：5′-ACT TCT GGG TGT CCA AAG AAT CA-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系：10×缓冲液5 μl，dNTP 4 μl，引物各1 μl，Taq DNA聚合酶0.5 μl，模板DNA 1 μl，加ddH₂O至50 μl。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32个循环，最后再72 ℃延伸10 min。反应结束后以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，PCR产物纯化回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

将测定序列在美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站上运行BLAST核酸序列同源性检索，从GenBank中选取与目的片段核苷酸序列同源性较高及近似属的序列，采用MEGA 5.1软件构建Neighbor-Joining（NJ）系统发育树，基于Kimura-2-parameter（K2P）模型计算遗传距离。

2只未知鼠样本经通用引物扩增后得到长度约750 bp的片段，与目的片段大小一致，经过测序、校对分析并去除两端错误碱基后，长度为692 bp。将未知鼠样本的COⅠ序列进行同源性比对，2只鼠个体间的COⅠ基因序列同源性为100%，为同一种鼠。采用DNAStar软件对该序列的碱基组成进行分析，结果见表 1。将序列在NCBI网站上运行BLAST核酸序列同源性检索，与样本COⅠ基因片段同源性最高的为青毛鼠（Berylmys bowersi），同源性为99%，见图 1。

表 1 未知鼠样本COⅠ序列核苷酸组成 Table 1 Nucleotide composition of COⅠ sequence in unknown rodent samples

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图 1 未知鼠样本的DNA条形码序列在NCBI中的比对结果 Figure 1 Results of the DNA barcoding sequences blasted in the NCBI

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从GenBank中选取与目的片段核苷酸序列同源性较高及近似属的14条序列（表 2），加上实验室饲养的褐家鼠（Rattus norvegicus）和黄毛鼠（R. losea）所测得的序列共16条。应用MEGA 5.1软件构建NJ系统进化树（图 2），显示本研究的2只未知鼠序列聚在一起，与GenBank中的巨鼠属（Berylmys）聚为一类，并与青毛鼠（JN105108.1）聚为一支，相似度为99.5%，推断2只未知鼠均为青毛鼠。

表 2 未知鼠序列与GenBank中相似性较高的鼠种序列比较 Table 2 Comparisons of the unknown sample to its relative species from GenBank

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图 2 基于DNA条形码序列构建的系统发育树 Figure 2 Phylogenetic tree based on DNA barcoding sequences

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将未知鼠1序列与广东省其他啮齿动物黄毛鼠（R. losea）、板齿鼠（B. indica）、褐家鼠（R. norvegicus）、黄胸鼠（R. tanezumi）、大足鼠（R.nitidus）、北社鼠（N. confucianus）、针毛鼠（N. fulvescens）和屋顶鼠（R. rattus）进行遗传距离比较，其中黄毛鼠和褐家鼠为实验室饲养个体所测序列，其他鼠种为GenBank中获取序列。经过双参数法计算可知，未知鼠1基因序列与青毛鼠（JN105108.1）的遗传距离最接近，为0.004 6，进一步确认未知鼠1为青毛鼠；其次是与针毛鼠（KC010237.1）的遗传距离为0.116 6，种间遗传距离是种内遗传距离的25.35倍。与未知鼠1遗传距离最远的是板齿鼠（JQ667597.1）和屋顶鼠（AB752801.1），遗传距离分别为0.156 5和0.156 4。9种鼠中，同属种间遗传距离最近的为黄胸鼠（JQ906931.1）和屋顶鼠（AB752801.1），遗传距离为0.039 3，最远的为大足鼠（JQ918374.1）和屋顶鼠（AB752801.1），遗传距离为0.142 0；而属间遗传距离最近的为未知鼠1和针毛鼠（KC010237.1），遗传距离为0.116 6，最远的为北社鼠（KP745971.1）和板齿鼠（JQ667597.1），遗传距离为0.168 1，见表 3。

表 3 广东省主要啮齿动物的种内和种间遗传距离 Table 3 Intraspecific and interspecific genetic distances of main rodents in Guangdong province

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青毛鼠隶属于鼠科（Muridae）巨鼠属，广泛分布于印度、印度尼西亚、老挝、马来西亚、缅甸和泰国等国家，在我国华南热带、亚热带地区均有分布，主要分布于福建、广东、浙江、安徽、四川等省，多见于森林、田野^[13]。青毛鼠属大型鼠类，体较细长，尾长为体长的105%~115%，后足长一般＞50 mm，耳大而薄，向前拉可以遮住眼部。体背毛青褐色，两侧呈青灰色，腹毛及四肢内侧均为白色，背腹毛色在体侧有明显的分界线。尾青褐色，上下毛色基本一致。前足背面灰白色，后足背面暗棕褐色。头骨较细长，脑颅较低平，门齿孔较短，后端达不到臼齿前缘的水平线。听泡较大，其长度接近枕鼻长的15%。鼻骨前端突出门齿外，其后端与前颌骨后端平齐。上颌第1臼齿最大，第3臼齿最小，约为第1臼齿的一半。第1臼齿第1横嵴前外齿突发育不全，内侧齿突较发达并向后延伸，中间齿突较大。第2横嵴的3个齿突都较发达，内侧齿突亦向下延伸，第3横嵴内外齿突均消失，中央齿突特别发达。第2臼齿第1横突退化，仅余内侧1个齿突，第2横嵴齿突发育正常，第3横嵴内外齿突均消失，中央齿嵴特别发达。第3臼齿第1横嵴退化，仅余1个内齿突，第2、3横嵴连接成环状。青毛鼠为广东省偶见鼠种，仅通过外形特征难以进行准确鉴定，利用头骨和牙齿特征进行鉴别对鉴定人员的专业分类知识要求很高，故采用DNA条形码对未知鼠样本进行鉴定，2只未知鼠样本虽然外形差异较大，经鉴定基因相似度为100%，为同一种鼠，推测样本1为青毛鼠成体，样本2为青毛鼠幼体。

Hebert等^[14-16]曾对动物不同种群进行种类鉴定，发现同属种间COⅠ序列的平均差异程度为11.3%，而种内COⅠ序列差异程度基本＜2%，绝大部分＜1%。本研究未知鼠与青毛鼠的遗传距离＜1%，而同属种间的遗传距离均＞3%，与Hebert等^[14-16]研究结果一致。

传统的形态分类学在长期的发展过程中暴露了一些不足之处，如无法鉴定种群中普遍存在的隐存分类单位、受生物性别和发育阶段的限制等，因而无法满足科学发展的巨大需求。而DNA条形码技术可作为传统形态学鉴定的有效补充，快速准确地进行物种鉴定^[17]。由于分子生物学方法需要在实验室条件下利用专用试剂盒、PCR仪等实验设备完成生物鉴定，对于从事野外工作的科研人员和林业工作者比较受限，且单纯依赖DNA条形码进行鉴定，会使鉴定人员缺乏通过实物鉴定物种的能力及缺乏形态学检验，导致可靠性降低。因此，在鉴定需要重点保护的物种时，应将传统分类学鉴定方法和现代分子生物学方法进行结合，以保证鉴定结果准确可靠^[18]。