虫媒传染病严重危害人类健康，据统计，半数以上传染病由媒介生物传播。随着国际化交流日益增多，已被消灭的虫媒传染病死灰复燃，新的虫媒传染病也接踵而至。蚊虫作为多种虫媒疾病的传播媒介，是医学界重点防控的昆虫之一。控制蚊虫是我国蚊媒传染病防治的重要环节，化学防治因见效快而成为主要防控手段。随着对杀虫剂的过度依赖及长期滥用，导致蚊虫抗药性的产生^[1-2]。研究蚊虫抗药性的产生机制并适宜治理实为当务之急。近年来，有关蚊虫抗性基因的报道日益增多，谭文彬等^[3-4]首次验证铁离子应答元件结合蛋白1（IRE-BP1）基因在白纹伊蚊（Aedes albopictus）溴氰菊酯抗性种群中的表达量是敏感品系的7.36倍，在淡色库蚊（Culex pipiens pallens）溴氰菊酯抗性种群中的表达量是敏感品系的8.22倍。王霄等^[5]以同样方法证明，IRE?BP1基因在中华按蚊（Anopheles sinensis）氯氰菊酯抗性种群中的表达量是敏感品系的9.42倍。大量实验结果提示，该基因在白纹伊蚊、淡色库蚊及中华按蚊对菊酯类杀虫剂产生抗性的机制中存在一定作用，可作为新的抗性检测及治理基因靶标。谭文彬等^[6-7]同时验证转铁蛋白基因在淡色库蚊氯氰菊酯抗性种群中的表达量是敏感品系的12.60倍，在中华按蚊溴氰菊酯抗性种群中的表达量是敏感品系的11.50倍。王霄等^[8]实验结果证明，转铁蛋白基因在白纹伊蚊抗性种群中的表达量是敏感品系的10.51倍，首次验证转铁蛋白基因在白纹伊蚊溴氰菊酯抗性种群中高表达，提示转铁蛋白基因与淡色库蚊、中华按蚊和白纹伊蚊对菊酯类杀虫剂产生抗性的机制相关。铁蛋白、IRE?BP1和转铁蛋白同属于铁代谢相关蛋白。目前，关于铁蛋白基因与蚊虫对杀虫剂抗药性的报道尚属空白，证明两者的相关性对于深入研究蚊虫的抗性机制具有重要理论意义。

淡色库蚊敏感品系为山东省寄生虫病防治研究所保种，已传70余代，4龄蚊幼虫对氯氰菊酯的半数致死浓度（LC₅₀）为0.05 mg/L；抗性品系为山东省寄生虫病防治研究所由氯氰菊酯逐代汰选而成（LC₅₀为7.80 mg/L）。

RNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；HisScriptⅡOne Step cDNA Synthesis Kit、2×Taq Master Mix、Ultra GelRed、DNA Marker、ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；荧光定量PCR仪（Linegen9600 plus）购自杭州博日科技有限公司。

采用氯仿法，分别取敏感品系及抗性种群淡色库蚊4龄幼虫约25 mg，加液氮研磨为粉末后匀浆，试剂盒提取总RNA。将提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，检验提取RNA的完整性。合成cDNA第1链：25 ℃ 5 min，50 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min；普通PCR扩增，正向引物：5′-CGC CGT CCT GTC CTT CTA-3′，反向引物：5′-TCC CTT GTG CTG CTC GTC-3′。94 ℃ 5 min预变性；94 ℃ 30 s、48 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 7 min彻底延伸。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后于紫外灯下观察。

PCR产物切胶回收、纯化，连接克隆载体，转化感受态大肠埃希菌（Escherichia coli），扩大培养后抽提质粒，酶切鉴定送测序。序列比对PubMed的核酸和蛋白数据库。

PCR根据测序结果设计引物，铁蛋白正向引物：5′-TTA CGA ATG CTG AGC GTG AC-3′，反向引物：5′-CCG GTC AAC AAG AAC ACC TT-3′。内参β?actin正向引物：5′-AGG ACT CGT ACG TCG GTG AC-3′，5′-TGG TGC CAG ATC TTC TCT CCA T-3′。合成cDNA第1链：25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min；产物用于后续荧光定量PCR，94 ℃ 30 s预变性；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。

利用Excel 2007 软件建立数据库，实验所得数据录入计算机，并利用GraphPad Prism V5.01软件进行两独立样本均数的t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

淡色库蚊4龄蚊幼虫28S RNA和18S RNA电泳条带清晰，无降解的5S条带出现，说明RNA提取成功，见图 1。

注：M. Marker；F. 总 RNA 图 1 淡色库蚊RNA电泳结果 Figure 1 The electrophoretogram of ferritin gene for Culex pipiens pallens

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获得的PCR产物长度为496 bp，见图 2。

注：M. DNA Marker；F.扩增DNA片段 图 2 淡色库蚊铁蛋白部分基因扩增产物电泳结果 Figure 2 The PCR product of ferritin gene for Culex pipiens pallens

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淡色库蚊铁蛋白基因部分片段测序峰见图 3。

图 3 淡色库蚊铁蛋白基因扩增产物测序片段 Figure 3 The sequencing image segment of ferritin gene of Culex pipiens pallens

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通过序列拼接软件DNAStar Lasergene. V 7.1进行双向序列自动拼接，得到的淡色库蚊铁蛋白基因部分基因如下：TTC CCT TGT GGT GCT CGT  CCA  GGT ACT CTC  CGG  TCA  GGT AGT  CGA  CCA GGT  GGT AGT  CGT TCT  TGT CTC CCT CGC AGA CCT TGA TCA GGT  TAC GAA TGC TGA  GCG  TGA  CTT CTT  GCT CCT TCT TCA  GGG  CGT  CCT  CCA  AAG CGG ACA ATC  CGT TGG  TGG CGG  CCG  GGA CCT TGT AGC TAT AGT  CCA  GCT GGA AGG TGT TCT  TGT TGA  CCG GTT  CCT  TTC CGC  GCA  TCA  GGG  CGT ACT  CGA TCA GCT  TGA TGC CGT GCT  CGC GCT  CCT CGC  CGG CGG  CGT  GGA AGA AGA ACT  TCT  CAA AGC  CGG  GCA  GGT TGA  TCT TCT CCT  GGG CAA AGT  AGG  CGG CGT ACT  TGA  GGT  ACA CGA  TCG  ACG CGT CAA  ATT  CCT TCT TGA TCT GAC  CGT  GCA GCG CGT CCA CGC AGC  TCC GGT  GCA AGT CGT  CCC  ACA CGT  ACT CGC GCT  CCA  GAT CAA  CGC CAG TTT  GCT GGG CCA  TGG  CCG  GTT  CCT GGT AGA  AGG  CAG GGG  ACG  GCG A。

在美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站上将该段序列进行BLAST核酸序列同源性检测，结果显示，该段序列与基因库中致倦库蚊（Cx. pipiens quinquefasciatus）的同源性最高，达99%，见图 4。

图 4 淡色库蚊铁蛋白部分基因序列在NCBI中的比对结果 Figure 4 Results of the ferritin gene sequences of blasted in the NCBI

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成功扩增预设计的121 bp条带，见图 5。根据通用公式2（R_t－E_t）＝2（R_n－E_n），ΔCt_敏＝F_敏－β_敏＝11.41－10.03＝1.38，ΔCt_抗＝F_抗－β_抗＝15.73－18.27＝-2.54，ΔΔCt＝ΔCt_抗－ΔCt_敏＝-3.92，2^-ΔΔCt＝15.08。利用GraphPad Prism V5.01软件进行数据分析，F检验判断两样本方差齐性，两样本铁蛋白表达差异无统计学意义（F＝1.050，P＞0.100），还不能认为两总体铁蛋白表达量的总体方差不等，故两样本采取总体方差相等时的两独立样本均数的t检验。结果显示，淡色库蚊抗性种群和敏感品系铁蛋白表达量差异有统计学意义（t＝26.100，P＜0.001），推断淡色库蚊抗性种群和敏感品系中铁蛋白基因表达量不同，抗性种群中铁蛋白表达量是敏感品系的15.08倍。

注：M. DNA Marker；F.扩增DNA片段 图 5 淡色库蚊铁蛋白部分基因PCR产物 Figure 5 The PCR product of Culex pipiens pallens ferritin gene

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铁是人体重要的微量元素之一，缺铁可导致机体多种代谢紊乱。铁蛋白是一种广泛存在于生物体内高度保守的多功能多亚基蛋白，铁蛋白的一个重要功能为储存铁。Reif^[9]研究发现，铁作为催化剂催化活性氧的生成反应，进而对DNA、脂质、蛋白质等造成损伤，影响生物体的各项生理功能，即铁过量导致慢性中毒。铁蛋白作为铁的储存库，可将生物体内过量的铁暂时储存，避免产生铁中毒现象。

本实验选用的淡色库蚊抗性种群是经氯氰菊酯汰选而来，氯氰菊酯属于拟除虫菊酯类杀虫剂，目前认为其作用机制是扰乱昆虫神经的正常生理，使之由兴奋、痉挛到麻痹而死亡。Reif^[9]报道百草枯通过单电子氧化还原反应促进铁蛋白中铁的释放，铁过量致使机体病变甚至死亡。Torti和Torti^[10]、Thomson等^[11]认为细胞内铁的动态平衡主要依赖铁调控蛋白（iron-regulatory proteins，IRPS）和铁反应元件（iron-responsive element，IRE）相互作用的铁依赖调节机制。IRE和IRPS具有高亲和力，两者通过形成复合物参与核糖体翻译。Thomson等^[11]发现，细胞内铁浓度较高时，IRE/IRPS复合物形成减少，从而促进铁蛋白的翻译，储存过量的铁。氯氰菊酯作为诱导剂促进细胞内铁的释放，高浓度的铁又引起铁蛋白基因进行高表达，故对其产生抗性的淡色库蚊体内铁蛋白表达量高于敏感品系。本研究序列比对结果表明，淡色库蚊铁蛋白基因与同属蚊科的致倦库蚊同源性最高，符合致倦库蚊和淡色库蚊同属尖音库蚊复合组（Cx. pipiens complex）的事实。由此断定，本实验所扩增片段为铁蛋白的基因序列。荧光定量PCR结果显示，铁蛋白基因在淡色库蚊抗性种群中表达量高于敏感品系，说明该基因在抗药性机制中存在一定作用。本研究首次验证铁蛋白在淡色库蚊氯氰菊酯抗性品系中高表达，提示该基因可能与淡色库蚊对菊酯类杀虫剂产生的抗性机制有关，为昆虫抗药性机制的研究及抗药性的分子检测提供了新方向，对淡色库蚊传播疾病的防治有一定应用价值。