汉坦病毒（Hantavirus，HV）属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）汉坦病毒属（genus hantavirus），各型HV可引发自然疫源性人畜共患病，其主要宿主为啮齿动物，可长期携带该病毒，引起肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒肺综合征（HPS），其中HFRS多发于欧亚大陆，HPS多发于美洲地区^[1-3]。HV自1978年被发现并成功分离，其分布不断扩大，新型或新亚型病毒不断被发现。目前HV至少可分为40个血清型或基因型，至少22个型HV可引起人类疾病，其中7个型别引起HFRS，另外15个型别引起HPS。我国为世界上报告HFRS病例数最多的国家，广泛分布汉滩型汉坦病毒（HTNV）、汉城型汉坦病毒（SEOV）和混合型HV^[4-5]。因该病毒的流行在地区、范围且强度上均不断扩大和增强，与其主要携带该病毒的鼠类新宿主也不断被发现。中国-哈萨克斯坦（中哈）边境线长约1 700 km，与哈萨克斯坦东部、巴尔喀什湖的东南部大沙鼠（Rhombomys opimus）鼠疫自然疫源地毗邻，是小兽的高发分布区，但对携带该病毒的小兽种类并不十分清楚。随着国际贸易的快速发展，小兽类可随飞机、轮船等交通工具在国际间扩散。为保障“一带一路”战略的实施与安全，了解该地区小兽自然携带HFRS疫情传播的流行情况，为预警监控提供依据。本研究利用特异性核酸检测方法，根据HV的M基因序列设计并合成特异性引物，对中哈边境地区捕获的小兽进行HV筛查，现将结果报告如下。

2016年1-11月在中哈边境线、铁路线两侧、口岸附近的城、郊、野外监测点，采用夹捕法和弓形夹法捕获小兽，以花生米为诱饵，晚放晨收，每只单独装袋送实验室用乙醚将动物麻醉，进行种类鉴定，采集其体表寄生物后无菌取肺脏进行核酸检测。

TRIzol Reagent购自Invitrogen公司；一步法RT-PCR试剂盒、DNA Polymerase、4×dNTP、DNA分子质量标准DL2000、DNA纯化试剂盒、IPTG、X-gal、pMD18-T Vector等试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司；宿主菌大肠埃希菌（Escherichia coli）XL1-blue，由大连医学媒介实验室保存。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

在生物安全柜内，参照Invitrogen公司TRIzol说明书，对抽取的95份小兽样本提取总RNA，按一步法RT-PCR试剂盒说明书进行反转录PCR，转录cDNA，保存至-20 ℃，备用。

分别扩增HTNV和SEOV，反应总体积50 μl，包括DNA Polymerase（1 U/ μl）2 μl，10×PCR Buffer 5 μl，4×dNTP 5 μl，模板2 μl，正、反向引物（20 μmol/L）各2 μl，ddH2O补充至总体积为50 μl，引物及反应条件见表 1。

表 1 PCR引物及反应条件 Table 1 The primer and PCR reaction conditions

表选项

吸取10 μl扩增产物，加至1%琼脂糖凝胶电泳加样孔中，恒压120 V、30 min后将胶样置于凝胶成像系统中观察并拍照。切下目的片段并纯化，纯化产物克隆后进行核酸序列测定。将测序结果通过DNAman和BLAST分析，利用MEGA 6.0软件构建遗传进化树。

2016年1-11月，中哈边境阿拉山口地区布放有效夹7 820夹次，捕获小兽300只，捕获率为3.84%。包括大沙鼠110只、小家鼠（Mus musculus）69只、红尾沙鼠（M. erythrourus）57只、小林姬鼠（Apodemus sylvaticus）22只、灰仓鼠（Cricetulus migratorius）12只、柽柳沙鼠（M. tamariscinus）10只、子午沙鼠（M. meridianus）8只、褐家鼠（Rattus norvegicus）6只、鼩鼱（Sorex araneus）3只、西伯利亚五趾跳鼠（Allactaga sibirica）和虎鼬（Vormela peregusna）各1只。

随机抽取95份鼠肺样本检测HV，检出阳性24份，其中大沙鼠11份，红尾沙鼠、子午沙鼠和柽柳沙鼠中各4份，灰仓鼠1份，其他小兽均未检出。24份阳性样本均携带SEOV，阳性率为25.26%（24/95）（图 1）。

注：M. DNA Marker；1~6.待测样本PCR产物；7~100.待测样本；NC.阴性对照 图 1 HV PCR检测结果 Figure 1 The electropherogram results of HV

图选项

大沙鼠为中哈边境地区非冬眠昼间优势种，红尾沙鼠、柽柳沙鼠和子午沙鼠也是该地带非冬眠但主要为夜间活动的常见种，灰仓鼠为昼夜皆活动的遍布种，5种阳性鼠种均为2016年5-9月采自中哈边境线阿拉山口段铁路沿线区域。

对24份阳性核酸片段进行纯化、克隆及序列测定、DNAman比对分析发现，有5个不同的基因型，分别为大沙鼠（ALSK-Ra-76、89、90、100）及子午沙鼠（ALSK-Ra-76），其余19条序列完全相同，同源性为98.41%。Blast序列分析发现，有6条序列与GenBank数据库中来自朝鲜褐家鼠的SEOV（JX853576）同源性达98.09%~98.33%。基于HV部分M基因序列构建系统发生树分析，本次发现的SEOV与汉城型DPRK08聚为一支，且与中国北京、河北及吉林等省（直辖市）病毒株亲缘关系较近，而与乌鲁木市齐褐家鼠的SEOV（Urumuqi55 KT188829）亲缘关系较远，见图 2。根据宿主及序列的差异性将子午沙鼠（MF136079、MF136080）、大沙鼠（MF136081、MF136082、MF136083、MF136084、MF136085）、灰仓鼠（MF136086）、柽柳沙鼠（MF136087）和红尾沙鼠（MF136088）序列上传至GenBank。

注：●.大沙鼠；○.子午沙鼠；▲.红尾沙鼠；◇.灰仓鼠；◆.柽柳沙鼠 图 2 HV部分M片段遗传进化树 Figure 2 Phylogenetic tree constructed from part of M gene sequence HV

图选项

对SEOV部分M基因序列进行同源性和系统发生树分析发现，5种鼠的阳性基因与朝鲜地区的DPRK08亲缘关系较近，而与乌鲁木齐市Urumuqi55 KT188829亲缘关系较远，因哈萨克斯坦无该基因型病毒报道而无法进行比对，提示该地区发现的病毒可能随物流引入，或因宿主动物、本地地理位置及环境气候而导致变异，有待进一步研究。本次检测仅对M基因部分序列进行了比较，信息量不足，今后有必要对其他基因序列进行分析，从而确定新疆地区该病毒的来源和进化变异规律。

流行病学调查发现，HV广泛分布于人和动物，其无症状、繁殖不受影响，人类可以通过接触被感染宿主动物的排泄物等途径而感染，是以鼠类为主要传染源的法定乙类传染病，也是国境口岸重点防控的传染病。自然界中有170种哺乳动物携带HV，大多数为啮齿动物，根据宿主动物划分为4个类群，包括鼠亚科、田鼠亚科、棉鼠亚科和食虫目相关病毒^[6-7]。追踪其传染源的监测结果，截至目前，黑线姬鼠（Apodemus agrarius）、小林姬鼠、大林姬鼠（Ap. peninsulae）、黄喉姬鼠（Ap. flavicollis）、褐家鼠、黄胸鼠（R. tanezumi）、大白鼠（R.norvegicus）、棕背鼠平（Clethrionomys rufocanus）、红背鼠平（C. rutilus）、普通田鼠（Microtus arvalis）、东方田鼠（M. fortis）、北社鼠（Niviventer confucianus）、黑线仓鼠（C. barabensis）、小家鼠和鼩鼱等30余种动物可自然携带HV^[8-10]。除啮齿动物外，部分家畜也可携带HV，如家猫、家兔、犬、猪等。在新疆地区已从褐家鼠、小家鼠和黑线姬鼠等啮齿动物中检出HV。2010年从乌鲁木齐市褐家鼠中检出SEOV^[11]。本研究为首次在大沙鼠、红尾沙鼠、子午沙鼠、柽柳沙鼠和灰仓鼠中检出SEOV，并将其基因序列上传至GenBank。

HFRS的流行地区分布于亚洲、欧洲、非洲和美洲的32个国家，疫源地分布于五大洲70多个国家，已成为世界公共卫生问题。我国为重疫区，占全球累积报告病例数的90%，除青海省外其他地区均有病例报告，每年发病数达数万至10余万例，疫区仍在不断扩大^[12]。中哈边境地区的小兽种类较多，数量大、分布广，危害严重，其适应性强和繁殖迅速。目前，新疆维吾尔自治区及边境地区已知小兽10科34属75种。小兽与人类的经济密切相关，直接和间接地骚扰及威胁人类的生产、生活与安全。随着口岸贸易和铁路交通事业的发展，物流频繁和人群活动不断增加，可能会加速HV疫区在新疆地区的蔓延。因此，通过对小兽携带的HV进行系统地研究，对防控HFRS有重要意义。