湖北钉螺(Oncomelania hupensis)是我国流行的日本血吸虫(Schistosoma japonicum)的唯一中间宿主, 控制或杀灭钉螺可阻断血吸虫病的传播和流行。研究化学药物、植物药物或活体植物的化感作用, 或物理灭螺方式对钉螺的影响, 均需要重要的观察指标—钉螺中枢神经节的形态及其功能变化。不同灭螺药物或影响因素对钉螺中枢神经节的细胞结构、生化指标和酶学特点等可产生不同影响, 其对杀灭钉螺、控制血吸虫病具有指导性意义。现就湖北钉螺中枢神经节的研究概况进行综述。

1 解剖方法 1.1 获取钉螺软体

湖北钉螺中枢神经节位于其头颈部的软体组织内, 获取钉螺中枢神经节首先去螺壳, 游离钉螺软体。常用去螺壳方法有止血钳夹碎法^[1]、玻片重压法^[2]和敲碎法^[3]等, 其中止血钳夹碎法对钉螺软体的损伤最小, 而玻片重压法更简单快捷, 适用于批量钉螺的快速检测^[4]。谭苹和于志君^[5]在止血钳夹碎法的基础上进行改进:①将钉螺垂直置于止血钳改为平行, 厣盖端朝止血钳头端; ②在钳夹钉螺的止血钳头端, 垫入较钉螺厣盖端稍窄的物体。改进后, 当捏合止血钳时仅螺壳破损, 有效地避免了钉螺软体组织损伤。

1.2 分离中枢神经节

周晓农^[2]介绍了钉螺中枢神经节的分离方法, 谭苹和于志君^[5]进一步用照片形式展示了分离中枢神经节的详细过程, 其关键步骤是用解剖针刺入钉螺软体的口腔, 然后向上挑破头颈正中部皮肤并向两侧分开皮肤及皮下组织, 逐步暴露出下面的中枢神经节, 再仔细分离神经节周边组织, 最终得到完整的中枢神经节。

2 显微解剖形态

钉螺属于软体动物门(Phylum Mollusca)腹足纲(Class Gastropoda)前鳃亚纲(Subclass Prosbranchia), 李赋京^[1]描述的钉螺中枢神经节有脑神经节、咽下神经节、胸神经节(侧神经节)和足神经节各1对, 肠上神经节、肠下神经节和脏神经节各1个, 两个相同的神经节通过联合横向相连, 两个不同的神经节通过连索纵向相连, 并围绕咽管形成咽神经环; 因胚胎期螺体扭转, 这些神经节与神经联合和连索扭曲交错成“8”字, 故前鳃亚纲又称为扭神经亚纲(Streptoneura)。金志良^[6]对钉螺中枢神经系统进行深入研究, 首次将钉螺神经系统的大体解剖推进至显微解剖水平, 提出钉螺神经系统包括神经中枢和外周神经, 神经中枢由神经节、神经节间的联合或连索组成; 外周神经是指中枢神经节发出并分布于内脏的神经, 分为运动神经和感觉神经, 并根据神经节的大小和发育的分化顺序将钉螺中枢神经节分为一级和二级。

2.1 一级神经节

包括脑神经节和足神经节各1对。

2.1.1 脑神经节

位于食道前端背面, 长0.29~0.36 mm, 背面蝶形, 侧面蛹形, 腹面豆状。金志良^[6]依据神经的发出部位和外形, 首次将钉螺的脑神经节划分为7个神经叶:吻侧叶、脑-口球叶、触角叶、脑联合叶、脑-侧足叶、视叶和脑-足叶, 并由7个神经叶分别向前方发出6对神经、4对连索和1条脑联合。Jahan-Parwar和Fredman^[7]依据腹足纲后鳃亚纲的加利福尼亚海兔(Aplysia californica)脑神经节的结构、电生理及神经纤维投射等特征, 将海兔的脑神经节分为7个不同的细胞群, 戴鸿佐和李瑞秋^[8]发现腹足纲肺螺亚纲褐云玛瑙螺(Achatina fulica)的脑神经节细胞群数目也是7个, 可能这几种不同动物脑神经节的7个细胞群并不存在密切对应关系, 但说明这类动物脑神经节内的结构已发展到具有相当复杂的程度。

2.1.2 足神经节

为脑神经节腹面的1对豆状神经节。横径0.28~0.30 mm, 纵径0.34~0.36 mm。内侧为足联合, 腹面前、后方分别发出前、后足神经节, 末端分别为前、后足2对卵圆形的二级神经节。

2.2 二级神经节

包括:①左右侧神经节和食道上下神经节, 该2对神经节成对而不对称; ②前足、后足、触角和口球神经节, 该4对神经节成对且基本对称; ③不成对的二级神经节2个:嗅检器神经节和脏神经节各1个。中枢神经节解剖部位和形态的确立奠定了研究中枢神经节生理功能和病理改变的重要基础。

3 光镜下的组织形态

谭苹等^[9]用琼脂-石蜡双包埋法制作湖北钉螺中枢神经节的组织切片标本, 解决了钉螺中枢神经节体积微小不易制作组织切片的难题, 经苏木素-伊红染色(HE)染色后, 于光学显微镜下观察到钉螺中枢神经节由表面的神经节被膜、被膜下的胞体区及中央区的神经纤维网组成。胞体区可见密集的神经细胞核, 其大小不等、形态不一, 多呈圆形或近似圆形。该结构特点与同属腹足纲前腮亚纲的脉红螺(Rapana venosa)^[10]、扁玉螺(Neverita didyma)^[11]及褐云玛瑙螺^[8]中枢神经节的组织结构相似, 且该3种螺的中枢神经节胞体区内呈现形态相似的神经细胞分区分布的现象, 支持了解剖学提出的神经节分叶理由。但湖北钉螺中枢神经节内是否存在形态相似神经细胞分区分布现象, 有待进一步研究。因已有报道研究方法中仅有HE染色, 其使细胞核着色较好, 但细胞轮廓不够清晰, 故需进一步采用金属浸镀技术显示完整的神经细胞、神经胶质细胞及两者间的立体空间关系。

4 电镜下的细胞形态 4.1 神经节被膜

谭苹等^[12]在透射电镜下观察了湖北钉螺的中枢神经节, 发现神经节最外层为一种染色灰淡而无一定结构的均匀云絮状物质, 其间含有不同形状的管状结构和不规则形状的高电子密度结构, 间断分布于绒絮层外缘。根据神经节的组织学切片判断, 该绒絮状物质层即光镜下所见的结缔组织被膜层。

4.2 神经节胞体区

位于神经节被膜下层, 分布较多神经细胞和神经胶质细胞, 神经细胞形状不规则, 细胞ϕ10~30 μm。细胞核单个, 形状不规则, 位于细胞中央。胞质中最突出的特征为含有丰富的粗面内质网、滑面内质网和线粒体等细胞器, 表明神经细胞具有合成蛋白质的旺盛功能, 合成的蛋白质可能与产生神经递质有关。胞质中还含有较多聚集成行或散在分布的糖原颗粒, 显示功能活跃的神经细胞具有丰富的能源供给。

4.3 神经纤维网

位于神经节胞体区中央, 是聚集的神经细胞突起, 呈纵行、横行及斜行立体交错排列, 剖面可见清晰的神经微管; 孙慧等^[13]在透射电镜下观察到纤维网中有清晰的神经纤维板层结构, 认为纤维网中的神经纤维是有髓神经纤维, 与李霞等^[14]报道的脊索动物柄海鞘的神经纤维相同, 均为有髓神经纤维。李文桂等^[15]观察到神经细胞突起内含许多ϕ25~50 Å的空心球形小泡, 该形态特点提示神经递质的存在。在质膜与高电子致密线间可见典型突触, 突触前膜和后膜并行排列, 其间有250 Å突触间隙。间隙内有电子着色较深的物质, 突触前膜有深染物质附着, 突触前区有椭圆形的线粒体和许多ϕ25~50 Å空心球形小泡, 突触后区仅见空心球形小泡。这些形态特点恰好印证了神经递质的释放过程。

5 酶组织化学特点

随着酶组织化学与细胞化学方法的应用, 使测定钉螺软体内不同酶在不同部位的分布及强弱程度成为可能, 但目前可用酶组织化学与细胞化学方法显示出来的、并可定性、定位和定量的酶还较少^[16]。用于湖北钉螺中枢神经节的酶学研究主要为乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、胆碱脂酶(CHE)、三磷酸腺苷酶(ATPase)和一氧化氮合酶(NOS)等。酶活性的改变直接影响到钉螺的代谢及生存。

5.1 LDH

几乎分布于所有生物细胞, 是无氧糖酵解途经的重要酶。梁幼生等^[17]首先采用文献[18]方法显示钉螺软体LDH, 于光学显微镜下可见钉螺中枢神经节的胞体区呈强阳性反应, 中央神经纤维网区呈阳性; 该结果与谭苹等^[19-20]结果相同, 提示中枢神经节内存在无氧糖酵解途径。

5.2 SDH

作为线粒体能量代谢的重要标志酶, 其反映了三羧酸循环的状况。梁幼生等^[17]和顾文彪等^[21]采用文献[22]方法显示钉螺软体SDH, 发现钉螺中枢神经节胞体区及中央区神经纤维网均呈强阳性; 说明SDH在钉螺中枢神经节内活性较高, 三羧酸循环供能途经活跃。

5.3 CHE

普遍存在于脊椎动物和一些无脊椎动物体内, 参与神经介质的传递、肌肉运动及物质代谢等多项生理功能, CHE活性的强弱是神经细胞性质和功能的重要参考指标。梁幼生等^[17]、李洪军等^[23]、李文桂和唐超^[24]采用文献[25]方法显示钉螺软体CHE, 光学显微镜下可见钉螺中枢神经节的胞体区呈强阳性反应, 中央的神经纤维网区呈阳性; 表明正常钉螺的神经节和神经干胆碱酯酶活性较高。

5.4 ATP

作为生物界普遍的直接供能物质, ATPase是生物体利用ATP的关键酶。谭苹等^[19-20]和顾文彪等^[21]采用文献[26]方法显示钉螺中枢神经节ATPase, 可见神经节的胞体区呈强阳性, 中央的神经纤维网区呈阳性; 表明正常钉螺中枢神经节内能量代谢十分旺盛。

5.5 NOS

Garthwaite等^[27]提出一氧化氮(NO)作为一种信息传递物质在中枢神经系统起重要作用, 是催化NO生物合成的唯一限速酶, 其活性与合成NO呈正相关。Huang等^[28]用生物化学和分子生物技术观察到腹足纲罗曼蜗牛(Helix pomatia)的中枢神经系统中存在NOS, 并用组织化学方法进行定位。Park等^[29]证明了在腹足纲静水椎实螺(Lymnaea stagnalis)中NO不仅作为突触信使参与突触传递, 还参与非突触信使的传递调节作用, 如软体动物的嗅觉过程^[30]、摄食活动^[31]等及参与神经蛋白和神经肽的释放^[32]。通常显示NOS方法采用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸硫辛酰胺脱氢酶(NADPH-d)酶组织化学技术^[33], 张仪等^[34]、梁幼生等^[35]、杨坤等^[36]观察发现NOS在钉螺中枢神经节呈强阳性反应, 与Pisu等^[37]用酶组织化学和免疫组织化学观察腹足纲散大蜗牛(H.aspersa)的NOS结果相似, 说明钉螺中枢神经节内同样存在较高活性的NOS。但NO在钉螺体内所发挥的作用还未见相关报道。

6 理化因素的影响 6.1 气候地理因素

地表温度、植被、降雨量及地理位置等气候地理条件是影响钉螺生存和繁殖的重要因素^[38-39]。杨坤等^[40]研究发现, 当环境温度升高为25 ℃时, 钉螺神经节的SDH、CHE及NOS活性均较实验组明显增强, 并可通过多种生理或病理效应提高钉螺的活动性及生殖腺丰满度, 增强钉螺的活动、摄食、能量贮备、个体发育及繁殖力。当环境温度降低至0 ℃以下时^[36], 钉螺中枢神经节的NOS活性或含量下降, 钉螺的活动及摄食明显减少; 在冬季水淹30、60 d的情况下^[41], 钉螺软体组织中的ATPase活性降低, 而LDH、SDH活性异常升高, 使螺体内糖代谢异常加快、贮存消耗加速, 最终导致“能源枯竭”加剧, 促进螺的死亡。但冬季水淹对中枢神经节内该几种酶活性的影响未提及, 待进一步研究。

6.2 化学、植物药物及生物因素

杀灭钉螺的药物种类繁多, 机制各不相同, 已报道作用位点破坏钉螺中枢神经节的组织结构及酶学活性的化学药物有氯硝柳胺^[15]和五氯酚钠^[24]等; 植物药物有血水草生物碱^[13]、空心莲子草^[20]和苦楝叶^[21]等; 微生物有紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)^[19]等。此外, 还有较多化学和植物药物有明显的杀螺作用, 有报道从植物内生真菌中筛选出新型灭螺药物^[42], 但其作用机制、作用位点及对钉螺中枢神经节的影响尚未见相关报道。

7 讨论

湖北钉螺中枢神经节的研究主要是解剖方法、显微解剖形态、光镜下的组织形态、电镜下的细胞形态、酶组织化学特点及化学、植物药物和气候因素、生物因素的影响方面, 但仍待进一步完善, 如补充扫描电镜数据将对钉螺脑神经节的外形及发出神经的部位和走向提供进一步佐证。另外, 金志良^[6]依据钉螺脑神经节发出神经部位, 将脑神经节划分为7个神经叶, 而脑神经节内的神经元分布是否存在相应区域聚集或区域差异至今尚无组织学证据, 对钉螺的行为活动、药物作用位点的研究具有重要意义。迄今已报道的化学和植物灭螺药物种类以及其他灭螺因素较多, 但相应作用机制研究较少, 随着钉螺中枢神经节解剖方法的应用^[5], 将钉螺中枢神经节作为检测药物作用位点的常规性观察指标成为可能。此外, 有关湖北钉螺中枢神经节与其产生的神经肽类物质的研究未见相关报道。国外有对静水椎实螺体内生物活性物质的研究, 该螺中枢神经系统的脑、口球、足和胸神经节内一些神经元含有多巴胺^[43]、在中枢神经系统和雄性生殖器官中含有APGWamide即丙氨酰-脯氨酰-甘氨酰-色氨酸的酰胺多肽, 其具有抑制成熟输卵管伸缩的活性, 对繁殖起主要控制作用^[44], 且该多肽家族成员目前发现仅存在于软体动物中^[45], 这些神经递质以极低浓度快速地改变神经细胞的代谢和功能, 从而发挥强大的调节作用。随着分子生物学、分子药理学的发展, 关于钉螺中枢神经节及产生的神经肽类物质的研究将有突破性进展。