西藏自治区人间鼠疫流行最早可追溯到20世纪初，1966年首次从日喀则市仲巴县的鼠疫患者尸体中分离到鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis，鼠疫菌），并通过流行病学调查证实西藏自治区存在鼠疫自然疫源地^[1]，为青藏高原喜马拉雅旱獭（Marmota himalayana）鼠疫自然疫源地，主要宿主动物为喜马拉雅旱獭，主要媒介为谢氏山蚤（Oropsylla silantiewi）和斧形盖蚤（Callopsylla dolabris）^[2]。西藏地区鼠疫疫源地动物间鼠疫流行呈持续活跃状态，疫源地面积逐年扩大，动物间疫情时而波及人间。1966-2015年，西藏地区共报告人间鼠疫疫情22起，造成120例发病、75例死亡的严重后果。

西藏地区鼠疫菌独特的生物学特性和超强的致病力是该地区人间鼠疫病死率较高的原因之一，也是区别于其他疫源地菌株的重要标志。为及时掌握西藏自治区鼠疫菌的遗传变化特征和地理分布情况，对2009-2011年分离自该地区的鼠疫菌进行了传统的生化特征鉴定和比较分析，现将结果报告如下。

111株鼠疫菌于2009-2011年分离自西藏自治区。其中来源于拉萨市36株（2009、2010年各8株，2011年20株）、山南市10株（2009年4株，2010年6株）、林芝市32株（2009年17株，2010年8株，2011年7株）、日喀则市2009年2株、阿里地区25株（2009年4株，2010年11株，2011年10株）、那曲地区2011年6株。除1株鼠疫菌于2010年分离自林芝地区的鼠疫患者外，其余110株均分离自喜马拉雅旱獭。

硝酸钾为Amresco（美国）公司产品；鼠李糖、L-（+）-阿拉伯糖为SIGMA（美国）公司产品；甘油、蛋白胨、牛肉膏等其他试剂均为国产。

按常规方法制备赫氏消化液培养基平板，37 ℃恒温培养24 h，确保无菌生长后，移入4 ℃冰箱，备用。用一次性无菌接种环蘸取菌种保存液，均匀涂布于赫氏消化液培养基平板上，28 ℃恒温培养18~24 h，使冻存菌株复苏。用一次性无菌接种环挑取复苏后的鼠疫菌单个菌落，连续划线接种于2块平板上，其中平板1用于鼠疫噬菌体裂解实验，平板2的培养物用于硝酸盐还原实验和糖醇酵解实验。

用微量移液器吸取25 μl诊断用鼠疫噬菌体，将其滴加在平板1的划线一侧，倾斜平板，使液体垂直流过划线。置28 ℃恒温培养24 h后观察有无噬菌带形成。

当平板1鼠疫噬菌体裂解实验为阳性时，取平板2上的培养物进行实验。按照《鼠疫防控应急手册》 ^[3]方法配制实验用培养基（每100 ml含0.1 g硝酸钾），甲液（0.8%氨基苯磺酸醋酸溶液）和乙液（0.5%α-萘胺醋酸溶液）。将待试菌株接种于脱氮反应用培养基后，置37 ℃恒温箱内培养2 d，加甲液0.1 ml混合后再加乙液0.1 ml，观察颜色变化情况。

采用常规试管法，首先配制甘油、鼠李糖和L-（+）-阿拉伯糖共3种糖醇培养基发酵管，配制方法参照文献[3]。用一次性无菌接种针挑取平板2上的鼠疫菌纯培养物，分别穿刺接种于上述糖醇发酵管内，置于37 ℃恒温培养7~14 d，每天观察并记录结果。同时用未接种菌的糖醇发酵管作空白对照。

111株鼠疫菌全部培养复苏成功，肉眼观察菌落形态呈圆形、淡灰色、中心凸起，符合典型的鼠疫菌菌落形态特征。

鼠疫噬菌体裂解实验结果均为阳性，在噬菌体流过处可见1条清晰的噬菌带。

111株鼠疫菌株全部具有硝酸盐还原能力，脱氮反应结果均为阳性，见表 1。

表 1 鼠疫菌株的生化实验结果

表选项

111株鼠疫菌均能酵解甘油，而不能酵解鼠李糖。9株鼠疫菌阿拉伯糖代谢结果呈阳性（发酵管由未接种时的紫色变成接种后的黄色），包括分离自那曲地区的6株和2011年分离自林芝市朗县、拉萨市当雄县、阿里地区噶尔县各1株；102株菌的阿拉伯糖发酵管均呈紫色或淡紫色，与空白对照管颜色相比，由于未发生明显的颜色变化，故将结果定为阴性，见表 1。

综合以上实验结果并根据鼠疫菌的生物型分型标准，111株鼠疫菌应全部属于典型的鼠疫菌古老变种（古典型鼠疫菌）。

西藏鼠疫自然疫源地是我国青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地的重要组成部分，分离自该疫源地的鼠疫菌具有毒力强、传播快、致死率高等特点。纪树立等^[4]根据鼠疫菌的糖醇酵解能力等6项指标建立了我国鼠疫菌的生态型分型体系，并将西藏自治区的鼠疫菌进一步分为冈底斯山型和青藏高原型，主要区别在于阿拉伯糖代谢能力和菌株的地理分布两方面。祁芝珍等^[5]报道，冈底斯山型菌株不能酵解阿拉伯糖，该型菌株主要分布在青藏高原的藏南谷地，而青藏高原型菌株则能够酵解阿拉伯糖，主要分布在藏北高原、青海高原、祁连山地及新疆维吾尔自治区、四川省的部分地区。藏北高原和藏南谷地间由于念青唐古拉山的地理分隔，使两地的鼠疫菌分离株表现出各自的生化表型特征。2009-2011年在西藏地区分离出111株鼠疫菌，其中6株来自藏北高原的那曲地区，其生物学特征与青藏高原型菌株相符，因此，可以确定这6株鼠疫菌的生态型为青藏高原型。拉萨、林芝、日喀则、山南市和阿里地区均地处藏南谷地，该地区的鼠疫菌大部分（102株）不能酵解阿拉伯糖，属于冈底斯山生态型。另有3株鼠疫菌（2011年分离自拉萨市、林芝市和阿里地区各1株）阿拉伯糖酵解实验结果为阳性，但不能认为该3株菌属于青藏高原生态型，需进一步应用基因分型方法对其遗传特征进行鉴定分析，如多位点可变数目串联重复序列分析^[6]、差异区段分型^[7]和间区规律聚集的短回文重复分型方法^[8]。综合运用这些基因分型方法可明确菌株的遗传特征和来源，有助于了解西藏地区鼠疫菌的传播扩散过程及疫源地变迁情况。