布鲁氏菌是一类革兰阴性的短小杆菌，牛、羊、猪等动物最易感染，可引起母畜传染性流产。人类接触带菌动物或食用病畜及其乳制品，均可被感染^[1]。近年来人间布鲁氏菌病（布病）疫情出现明显回升，布病的发病率及发病例数逐年上升，已成为我国农村牧区主要的公共卫生问题。布病呈现由北方纯牧区向半牧半农区、农业区及城市，由北方向南方扩散的趋势，且越来越严重。作为非疫区的南方省份，农牧民对布病知识知之甚少，防控意识更加淡薄，且人类感染布鲁氏菌后多表现为发热、多汗等非特异症状，往往不能及时发现并确诊^[2]。本研究对2016年4月湖北省随州市就诊的3例疑似布病患者进行个案调查，全血培养出3株疑似布鲁氏菌，除常规方法鉴定和噬菌体裂解试验外，还比较了布鲁氏菌鉴定的多种方法^[2-6]。

湖北省随州市医院采用全自动血培养仪分离获取的疑似菌株，编号为SZ6575、SZ6579和SZ7205。标准参考菌株羊种菌16M、牛种菌544A、猪种菌1330S和疫苗菌株羊种M5、牛种104M和猪种S2的DNA，由中国疾病预防控制中心（CDC）传染病预防控制所布鲁氏菌病室冻干保存和提供。

生物安全柜（美国Thermo公司）；梯度PCR扩增仪、PCR离心机（德国Sigma公司）；电泳仪（北京八一仪器厂）；凝胶成像分析系统（上海天能公司）；恒温水浴箱（德国Sigma公司）；细菌浊度仪（上海艾牧生物科技有限公司）。A、M因子血清；R型布鲁氏菌血清；布鲁氏菌Tb和BK₂噬菌体；1:50 000（20 μg/ml）硫堇、碱性复红染料纸片；硫化氢滤纸片；布氏琼脂（美国BE公司）；DNA Marker DL2000、Premix Ex Taq（2×）（北京擎科新业生物技术有限公司）；10×Tris硼酸（TBE）电泳缓冲液、三胜黄素、琼脂斜面培养基，均由中国CDC传染病预防控制所布鲁氏菌病室提供。

3例患者均为湖北省随州市随县人，农民。其中2例为男性，年龄分别为48和59岁，养羊，发热1个月；女性1例，77岁，在邻居屠宰山羊过程中有所接触，发热1个月余，最高体温38 ℃。3例患者均为散发病例，以发热、多汗、关节疼痛和身体疲乏为主要临床表现，与北方流行区病例的临床症状无明显区别。虎红平板凝集试验和试管凝集试验均为阳性，结合流行病学调查诊断为布病。

硫化氢产生、硫堇、碱性复红抑菌试验，阳性血清、A、M和R血清凝集试验，布鲁氏菌噬菌体裂解试验，均参照原卫生部疾病预防控制局编著的《布鲁氏菌病防治手册》中的实验方法进行。

将纯分离菌株接种布氏琼脂试管斜面，37 ℃培养48 h。接种环取菌苔至加有双蒸水200 μl的离心管（1.5 ml）内，10亿/ml，混匀，在80 ℃恒温金属浴中加热1 h灭活，用TIANGEN细菌基因组提取试剂盒提取全基因组DNA，置于4 ℃冰箱中保存备用。

采用布鲁氏菌属特异性基因BCSP31作为定属基因，按照文献[2-3]提供的B4和B5引物序列和参数进行布鲁氏菌鉴定。反应体系20 μl：Premix Ex Taq（2×）10 μl，B4上游引物（10 μmol/L）0.4 μl，B5下游引物（10 μmol/L）0.4 μl，DNA 2 μl，ddH₂O 7.2 μl。扩增条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 55 s，55 ℃ 55 s，72 ℃ 1 min，30个循环。

采用参考文献[2-3]提供的AMOS-PCR引物及参数进行布鲁氏菌种的鉴定。反应体系25 μl：Premix Ex Taq（2×）12.5 μl，引物A（10 μmol/L）0.4 μl，引物M（10 μmol/L）0.4 μl，引物S（10 μ mol/L）0.4 μ l，引物（10 μ mol/L）1.0 μ l，DNA 1.5 μl，ddH₂O 8.8 μl。扩增条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40个循环。

反应体系25 μl：Premix Ex Taq（2×）12.5 μl，上游引物（10 μmol/L）0.75 μl，下游引物（10 μmol/L）0.75 μl，探针5 μmol/L 0.5 μl，DNA 2 μl，ddH₂O 8.5 μl。根据实验需要设计2个反应阶段：第1阶段95 ℃ 2 min；第2阶段95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，40个循环；荧光收集设置在62 ℃ 45 s时进行。

生化及血清学鉴定结果见表 1，SZ6575、SZ6579和SZ7205菌株均为羊种布鲁氏菌生物3型。

表 1 布鲁氏菌种型鉴定结果 Table 1 Species and biovar identification for the pathogen studied

表选项

BCSP31-PCR鉴定结果显示，所有菌株均有预期扩增，而阴性对照未见扩增条带，3株待检布鲁氏菌均有223 bp的特异性条带，提示为布鲁氏菌（图 1，左侧）；AMOS-PCR鉴定结果显示，分离株及阳性对照菌株核酸均扩增出羊种布鲁氏菌特异的731 bp条带，而阴性对照无条带出现（图 1，右侧）。

注：M. DNA Marker DL2000；1~3.强毒株（16M羊种、544A牛种、1330S猪种）；4~6.疫苗株（M5羊种、104M牛种、S2猪种）；7.阴性对照；8~10. 3株待检菌株（SZ6575、SZ6579、SZ7205）。 图 1 分离细菌BCSP31-PCR、AMOS-PCR扩增产物 Figure 1 BCSP31-PCR, AMOS-PCR amplification products of isolated bacteria

图选项

PCR鉴定随着循环数增加，阳性对照及3份样本荧光强度有不同程度增加，扩增曲线呈S形。阴性对照无扩增信号，排除了此次实验假阳性的可能，见图 2。

注：A.阳性对照扩增曲线；B、C、D.分别为分离的3株菌的扩增曲线；E.阴性对照扩增曲线。 图 2 荧光定量PCR扩增曲线 Figure 2 Fluorescence quantitative PCR of amplification curve

图选项

河南省南阳市近年来布病疫情多发，新发病例形成逐年剧增趋势，2015年布病新发病例高达1 293例。河南省信阳市及湖北省随州市近年来布病疫情多呈散发状态，新发病例也呈明显上升趋势，见图 3。

图 3 湖北省随州市及河南省南阳、信阳市2008－2015年布病发病情况 Figure 3 The brucellosis infection in Suizhou city of Hubei province and Nanyang city, Xinyang city in Henan province from 2008 to 2015

图选项

随州市位于湖北省北部，与河南省南阳和信阳市毗邻，地貌以山地、丘陵和平原河滩为主，历来为非布病疫区，自2010年发现首例患者后，疫情及病例数逐年增加，2015年布病发病数达到96例。病例呈散发状态，流行菌株为羊种布鲁氏菌3型。临床症状与北方患者相同，急性患者经过布病对症治疗，获得很好疗效^[3-4]。

与随州市毗邻的河南省布病疫情严重，2015年报告新发病例5 742例。随州市毗邻的河南省南阳和信阳市近几年的布病发病情况表明，布病疫情在临近区域相互影响，呈现跨省区传播的动物疫情影响人间疫情的特点^[5]。在北方的内蒙古自治区、山西和河北省，以及内蒙古自治区、吉林和黑龙江省邻省之间曾有此跨区域传播疫情^[6]。

布鲁氏菌实验的生物安全是开展布鲁氏菌分离鉴定的瓶颈，本实验在完成经典鉴定布鲁氏菌的基础上，探索利用PCR技术鉴定的可能。实验结果可见，除常规鉴定方法外，还可以在分离疑似菌株后，直接从培养液体中提取核酸，利用BCSP31-PCR及AMOS-PCR法鉴定布鲁氏菌的属和种，并且可在同一凝胶上完成属和种的鉴定，也可以直接利用荧光PCR进行鉴定，获得与经典鉴定方法同样的结果^[7-12]。

布鲁氏菌鉴定实验的对照菌株必不可少，但标准参考菌株是强毒株，增加了实验操作的生物安全风险，并且难以获得。在实验中使用牛、羊、猪种的3个疫苗菌株作为对照，在经典的表型鉴定、PCR鉴定和荧光PCR鉴定中均获得与3个标准参考株一样的结果，由此可见弱毒疫苗株在降低生物安全风险的同时可获得与标准菌株同样的效果^[13]。