沃尔巴克氏体（Wolbachia）属于变形菌门（Proteobacteria）、变形菌纲α亚门（Alphaproteobacteria）、立克次体目（Rickettsiales）、立克次体科（Rickettsiaceae）、沃尔巴克氏体属，为革兰阴性菌，是世界上分布最为广泛的共生菌，常见于节肢动物门和部分线虫体内^[1-2]。调查显示，至少65%的昆虫种类天然携带沃尔巴克氏体，其中28.1%的蚊种（包括29.6%的伊蚊、42.1%的库蚊和50.0%的曼蚊）携带沃尔巴克氏体^[3]。中国-哈萨克斯坦（中哈）边境阿拉山口口岸地区地处83°36′ E，45°12′ N，北接哈萨克斯坦国塔勒迪库尔干州阿拉湖，南接中国的艾比湖，湖面资源丰富，植被丰茂，为蚊虫孳生提供了条件。随着经济全球化发展，为蚊虫随交通工具、货物和人员往来入侵提供了便利，并增加了蚊媒疾病传入我国的风险。有文献报道，该地区蚊种以凶小库蚊（Culex modestus）为优势种，占46.0%^[4]，但该蚊种是否携带沃尔巴克氏体不详。1924年Hertig和Wolbach^[5]在尖音库蚊（Cx. pipiens）体内首次发现沃尔巴克氏体。我国广东、浙江省中东部仅在白纹伊蚊（Aedes albopictus）、骚扰阿蚊（Armigeressubalbatus）、致倦库蚊（Cx. pipiens quinquefasciatus）中发现感染基因型为wAlbA和wAlbB型的沃尔巴克氏体^[1-2]。本研究对中哈边境阿拉山口地区的优势蚊种凶小库蚊进行检测，根据检测结果对蚊媒疾病传播防控进行探讨。

2015年4－10月，在中哈边境一区、二区、阿拉山口艾比湖湿地自然保护区，用诱蚊灯、挥网法采集蚊虫，经显微镜观察及分类鉴定后选取凶小库蚊1 200只，按20只/组共分60组，待检。

按照DNA提取试剂盒（DNeasy^® Blood & Tissue Kit，QIAGEN公司）说明书对60组凶小库蚊进行DNA提取，置-20 ℃保存，备用。

用双翅目国际通用引物LCO1490和HCO2198扩增蚊虫线粒体COⅠ基因并测序，进行Blast分析，利用Mega 6.0软件构建系统进化树。

参照林立丰等^[2]报道的扩增沃尔巴克氏体wsp基因，选取阳性样本送北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司测序。将测序结果进行Blast分析，利用Mega 6.0软件构建分子进化树，分析凶小库蚊感染沃尔巴克氏体的wsp基因特征。

经分类鉴定，选取的凶小库蚊60组中有2组出现特异性条带，测序后得到2条沃尔巴克氏体序列，阳性率为3.33%（2/60）。

线粒体COⅠ基因经Blast比对显示，样本编号为ALSK-W011的凶小库蚊与GenBank中Cx. modestus（JN592735，英国）同源性为99%（647/649）；编号ALSK-W024的凶小库蚊与GenBank中Cx. modestus（KJ401305，丹麦）同源性为99%（653/657）。分子遗传进化树显示，中国阿拉山口口岸地区凶小库蚊与英国（JN592735）、丹麦（KJ401305）、土耳其（KJ012102）、俄罗斯（FM177758）及德国（HF562837）的凶小库蚊聚为一支，但ALSK-W011与ALSK-W024形成不同的分支，见图 1。由此可见，该地区的凶小库蚊线粒体COⅠ基因具有多样性。

图 1 凶小库蚊线粒体COⅠ基因系统进化树 Figure 1 Phylogenetic analysis of Cx. modestus mitochondrial cytochrome C oxidase subunitⅠ (COⅠ) genes

图选项

在60组蚊虫样本中有2组获得599~626 bp片段大小的条带，阳性率为3.33%。经阳性Blast分析显示，2条序列与沃尔巴克氏体的同源性均为99%，其中ALSK-W033与Pristophera geniculate的沃尔巴克氏体内共生体（EF658739）同源性最高；ALSK-W035与致倦库蚊的沃尔巴克氏体内共生体（KJ140126）的同源性为99%（566/572）。分子遗传进化树显示，2条沃尔巴克氏体序列被分成2个超级组别的2个进化分支，其中ALSK-W033及ALSK-W035分别为wAlbA和wAlbB型沃尔巴克氏体，分别属于Supergroup A和Supergroup B，见图 2。

图 2 沃尔巴克氏体基因系统进化树 Figure 2 Phylogenetic analysis of Wolbachia wsp genes

图选项

本研究显示，中哈边境阿拉山口口岸地区的优势蚊种凶小库蚊与英国、丹麦、土耳其、俄罗斯和德国的凶小库蚊同源性较高，聚为一支，该5国均为“一带一路”沿线国家。因此，推测该蚊种可能是随货物、交通工具等远距离活动于该地带的蚊种，以致有较高的同源性，但不能排除其他传播及活动因素，如鸟类的迁徙等^[6-8]，有待调查。

据国内报道，已知从43种蚊虫中分离到西尼罗脑炎、流行性乙型脑炎（乙脑）等病毒，其中大部分种类与其吸鸟血习性相关，凶小库蚊、尖音库蚊又是携带该病原体的主要媒介^{[4, 9]}。2014年刘然等^[10]从凶小库蚊中分离出1株新型布尼亚病毒，命名为艾比湖布尼亚病毒（Abbey Lake bunyavirus，Ab-BUNV）。2016年寨卡病毒病、登革热、黄热病及疟疾等蚊媒疾病扩散流行。随着我国“一带一路”战略的推进、中哈边境口岸的对外开放、沿线国家和地区经贸合作不断发展，蚊虫种群及蚊媒疾病通过交通工具、货物、行李等方式入侵、传播，严重威胁人类健康^[11-12]。近年来大多研究及初期实验显示，沃尔巴克氏体可抑制蚊虫体内的寨卡病毒^[13-14]。沃尔巴克氏体可阻止登革热病毒在蚊虫体内复制增殖，携带不同型别沃尔巴克氏体的雌雄蚊虫交配后产生的卵不发育，沃尔巴克氏体可通过诱导宿主间杂交的胞质不相融合，诱导单性生殖、雌性化和杀雄性等机制改变和影响其宿主的繁殖，利用携带沃尔巴克氏体的雌蚊生殖优势，使其扩散到蚊虫种群；同时沃尔巴克氏体在蚊虫体内对多种人类病原体（如登革热病毒、黄病毒和疟原虫等）产生抗性，利用此特性建立对生物、虫媒疾病的控制策略^[15]。将野生传病蚊媒改造成对人类病原体具有抗性的蚊种，使携带该菌的蚊种成为某地的优势种，登革热等疫情即可得到抑制^[16-17]。目前，美国、澳大利亚、巴西等国家相继开始投放“益蚊”。澳大利亚从2011年起，最早通过该措施抑制登革热疫情，释放实验持续了4年，目前未发现任何负面作用^[18-19]。根据中哈边境阿拉山口口岸地区的凶小库蚊种群携带wAlbA和wAlbB型沃尔巴克氏体的研究结果，可利用沃尔巴克氏体诱导胞质不相融现象，将感染不同类型沃尔巴克氏体的凶小库蚊的雌雄虫进行交配，使其子代发生双向胞质不相融而无法存活，从而降低凶小库蚊种群的密度，控制西尼罗脑炎、乙脑等多种蚊媒疾病。