虫媒病毒是指可在吸血节肢动物体内繁殖并能通过叮咬而引起人畜共患病的病毒，其主要传播媒介为蚊和蜱，我国已检测到多种虫媒病毒及虫媒病毒病^[1]。辽宁病毒（Liaoning virus，LNV）属于呼肠孤病毒科Seadornavirus属，为12节段双链RNA无包膜病毒。LNV的致病性研究表明，小鼠在接种2次LNV后出现鼻腔出血、皮下出血并死亡^[2-4]；另在发热病例体内也检测到LNV抗体^[5]，表明其有潜在的致病性。目前，北京市周边省份如山西、辽宁省等地已分离到LNV。

按照《病媒生物密度监测方法蚊虫》（GB/T 23797－2009）的方法，于2014－2015年6－9月，采用CO2诱蚊灯在公园、居民区等地采集蚊虫。采集时间在18：00－20：00，部分在18：00至次日06：00完成。标本采集后，迅速带回北京市朝阳区疾病预防控制中心（CDC）进行处理。将蚊虫标本采集网兜置于-20 ℃冰箱冰冻约30 min后，在铺有冰排的A4纸上进行分类，同类雌蚊按蚊种类分装于带螺口的冻存管，每管50~100只；在冻存管上做好蚊虫信息标记，并记录蚊虫标本采集信息。全过程应低温操作，将蚊虫标本装入布袋后迅速置于-80 ℃冰箱或液氮罐中保存。

使用组织研磨机（QIAGEN）研磨标本。按照核酸提取试剂盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit，Qiagen公司）方法提取RNA，用反转录试剂盒（Ready-to-Go You-Prime First-Strand Beads，GE Healthcare公司）合成cDNA。利用LNV第10基因片段的特异性引物^[6]进行PCR扩增，采用GoTaq^® Green Master Mix试剂盒（Promema公司），扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳，根据凝胶成像仪结果，将阳性标本送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，并在NCBI网站上进行Blast分析。

使用DNAStar和Sequencing Analysis v5.2软件进行序列拼接和质量分析。在GenBank上选取NE97-12（LNV-NE97-12）及NE97-31（LNSV-NE97-31）为代表毒株，分别代表LNV血清Ⅰ型（serotypeⅠ）和Ⅱ型（serotypeⅡ）；选取往年部分LNV、版纳病毒（Banna virus，BAV）及Kadipiro virus（KDV）序列为参考；部分参考序列为中国CDC病毒病预防控制所病毒性脑炎室提供。采用Mega 5.1软件的Neighbor-Joining（NJ）法进行进化树分析。

共采集蚊虫9 811只，其中淡色库蚊（Culex pipiens pallens）占捕获总数的91.41%，为优势种；三带喙库蚊（Cx. tritaeniorhynchus）、白纹伊蚊（Aedes albopictus）和中华按蚊（Anopheles sinensis）分别占2.73%、5.62%和0.24%；2014和2015年采集蚊虫分别为6 336和3 475只。8－9月采集的蚊虫标本数量最多，共占捕获总数的80.60%；淡色库蚊在6－9月均有采集，而三带喙库蚊仅在8、9月采集到，见表 1。

表 1 2014-2015年北京市朝阳区采集蚊虫标本情况 Table 1 Information of mosquitoes samples collected in Chaoyang district of Beijing, 2014-2015

表选项

共132只蚊虫标本经核酸提取后反转录为cDNA，用LNV第10节段的特异引物进行PCR扩增。结果显示，编号为BJCY14007的标本与目标片段大小相符，测序后经Blast比对分析，显示BJCY14007与LNV血清Ⅰ型代表毒株NE97-12的同源性达到93%，同时与新疆等地分离株同源性达99%，表明该阳性产物为LNV。

基于第10节段核苷酸序列的系统发育树（第51~753位核苷酸）显示，进化树分为3个大支，LNV、BNV及KDV分属不同类群，显示出该3种病毒存在种属差异。LNV分支群明显分为2个进化群，即血清Ⅰ型和Ⅱ型。新疆、山西、青海等省（自治区）毒株与代表株NE97-12均属血清Ⅰ型，2012年分离自辽宁省的毒株LN12002-1和LN12018-1与代表株NE97-31同属血清Ⅱ型。北京市LNV基因BJCY14007与代表毒株NE97-12在进化关系上更为接近，为血清Ⅰ型，且与分离自新疆地区的毒株最为接近，但也存在差异，见图 1。

图 1 辽宁病毒第10节段进化树 Figure 1 Phylogenetic tree based on the 10th segments of LNV

图选项

北京市曾报道多种虫媒病毒及虫媒病毒病，如流行性乙型脑炎（乙脑）病毒、BAV，输入性登革热，媒介蚊虫主要有淡色库蚊、白纹伊蚊、三带喙库蚊和中华按蚊等^[7]。本次系北京地区首次报道LNV。LNV最早于1997年分离自辽宁省，近些年在我国新疆、青海、辽宁、山西和甘肃等省（自治区）多种蚊虫中分离到^[8-12]。以往动物实验及血清学结果表明，LNV有其潜在的致病性；同属的BAV和KDV也为该病毒属，其中BAV被认为能引起脑炎等疾病。此外，LNV有较快的进化速率且媒介分布较为广泛，目前已在背点伊蚊（Ae. dorsalis）、中华按蚊、淡色库蚊、里海伊蚊（Ae. caspius）、尖音库蚊（Cx. pipiens）、黄背伊蚊（Ae. flavidorsalis）和凶小库蚊（Cx. modestus）等多种蚊虫媒介中检测到。北京地区优势蚊种为淡色库蚊，也有一定比例的中华按蚊，本次LNV的检出表明该病毒已存在于当地野外环境中。

LNV阳性标本BJCY14007采集自奥林匹克森林公园，媒介蚊种为淡色库蚊。各蚊种所占比例与历年监测数据相吻合，淡色库蚊仍为优势蚊种，三带喙库蚊也占有一定比例，其在北京城区的分布出现新的变化且在城区广泛分布，需注意乙脑等虫媒传染病的传播风险^[13]。根据中和试验结果，LNV可分为血清Ⅰ型和Ⅱ型，代表株分别为NE97-12和NE97-31。LNV第10节段编码外衣壳蛋白（VP10），在附着及侵入细胞方面有重要功能^[4]。基于LNV第10节段系统进化分析结果，BJCY14007与新疆、山西、青海省（自治区）的分离株较为接近，与代表株NE97-12归为同一分支群，同属血清Ⅰ型。目前NE97-31分支群（血清Ⅱ型）仍仅在辽宁省检测到，说明该型LNV目前仍局限在辽宁地区，显示出LNV的分布存在地区差异性，且血清Ⅰ型比Ⅱ型分布更为广泛。已有研究结果显示，LNV分布于我国北方地区的辽宁、新疆、山西、甘肃、青海、北京等省（直辖市、自治区），呈现地域分布规律^[14]，该病毒的分布可能受气温、湿度等气候因素限制。

北京市朝阳区坐拥首都国际机场、奥林匹克森林公园等湿地公园，流动人口多，有大量城郊区，区域环境卫生质量较差，易孳生蚊虫等虫媒病毒的传播媒介。近年来，北京市较流行马术运动，城郊区存在一定数量的牛、羊养殖户，朝阳区已有马术俱乐部近20家。且全球气候变暖、城市化、湿地建设及贸易全球化等因素影响蚊类的分布变化，病毒、蚊虫媒介与宿主三者间原有的平衡也发生改变。北京市2008年研究表明，蚊虫密度变化与气温密切相关^[15]。因此，应加强包括LNV在内的虫媒病毒研究，尤其是人群和动物宿主携带相关病毒抗体的情况，在不明原因发热及出血患者中开展抗体检测。此外，还应考虑蚊类分布及其季节消长规律，并继续监测蚊类携带病原体情况。目前，LNV在自然界的循环情况仍不清楚，LNV的时空分布规律及分子流行病学有待进一步研究。