赫氏培养基（赫金格尔琼脂培养基）是人工配制的适合鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）生长繁殖的营养物质，在鼠疫菌的分离、检验及保存过程中起到了至关重要的作用^[1]。鼠疫疫源地和疫情的确定均以分离到鼠疫菌为依据^[2]，而鼠疫菌的培养与分离则主要依赖于优质的培养基，其成分与质量直接影响鼠疫菌的生长、繁殖与分离^[3]。现就培养基制备过程中的影响因素、各组分的优化所采取的质控措施进行阐述。

1 赫氏培养基在鼠疫菌检验中的作用

基础培养基是含有鼠疫菌生长繁殖所需的基本营养物质，国内常用的有肉浸液琼脂和胰酶消化液琼脂，其中以胰酶消化液琼脂（赫金格尔琼脂）为优^[4]。赫氏培养基主要用于鼠疫菌的生长繁殖、分离纯化、保存、基础科学研究及生物制品的制备等。因此，提高培养基的质量对鼠疫菌的检测具有非常重要的意义。

2 制备赫氏培养基的影响因素 2.1 温度

在加入剁碎去脂猪胰脏和无水碳酸钠时，温度应控制在50～60 ℃，不能过高以免破坏其营养成分。制备好的消化液放入37 ℃恒温振荡培养箱消化7～9 d。

2.2 容器

所有容器在使用前根据不同情况，经过一定的处理洗刷干净，有的容器还要进行包装，经过高压灭菌后才能使用。配制培养基常用容器为玻璃、搪瓷或不锈钢制品，不使用铜、铁材质的容器，以防金属离子混入培养基中。玻璃器皿必须是中性硬料，否则影响培养基的酸碱度及鼠疫菌的生长。

2.3 培养基用水

培养基制备用水不能含有任何抑制或影响鼠疫菌生长的物质，应使用蒸馏水，尽量不用去离子水。

2.4 试剂

培养基所用化学药品均应是化学纯。

2.5 称量

称量时每种试剂应使用专用的药匙，使用一次性称量纸。

2.6 琼脂软硬度

琼脂作为培养基的固化剂，浓度的高低直接关系到培养基制成后的硬度，培养基的硬度与琼脂用量呈正相关。一般情况下琼脂低于0.5%，硬度较软，当浓度达到0.8%，硬度佳。软硬度应依据实验操作人员熟练度灵活调节，硬度较低的培养基有利于鼠疫菌生长，但鼠疫菌培养接种过程中容易划破培养基琼脂表面。

2.7 校正酸碱度（调节pH值）

培养基配制过程中调节pH值是一个关键环节，应在室温下进行。pH值调节可用NaOH溶液或HCl溶液，一般只用一种溶液缓慢调节，以免影响培养基的渗透压。培养基经高压灭菌后pH值会比高压前低0.2左右。

2.8 培养基的灭菌

培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌，普通培养基采用121 ℃ 30 min高压灭菌，特殊培养基可用间歇灭菌。培养基不宜多次高压灭菌，以免破坏其有效成分，影响鼠疫菌细菌培养^[5]。

2.9 添加剂

即在赫氏培养基内加入某种刺激鼠疫菌生长的因子，如硫酸亚铁、血液等，应把硫酸亚铁在玛瑙乳钵中研磨成粉末状，否则制成的培养基有黑色颗粒，影响鼠疫菌的观察。所加血液应是无污染的脱纤维兔溶血。

2.10 倾注培养基

从高压蒸汽灭菌锅中取出培养基，在倾注平皿时，应自然降温至40～45 ℃为宜，以减少平皿表面的冷凝水，利于观察培养结果。

3 制备赫氏培养基的质量控制 3.1 物理学控制

制备好的培养基使用前应检查培养基的色泽和透明度，防止被污染、蒸发、脱水等。

3.2 生物学控制

培养基在灭菌后，应做无菌实验，通常将制备好的培养基平皿放置37 ℃ 24 h培养，观察是否有细菌或霉菌生长。如果无细菌或霉菌生长，视为合格^[6]。对每批产品应用鼠疫参照菌株进行检验，并记录实验结果。

3.3 外观检查

液体培养基应清晰透亮，若有浑浊或沉淀，可能为其自身成分析出或细菌污染所致，此培养基不应使用；若固体培养基表面出现干裂，血平皿出现溶血或有菌膜及菌落生长均不能使用；培养基的pH值若超过规定值±0.2者也不应使用^[7]。

3.4 生长特性及生长率

将鼠疫菌接种至固体、半固体或液体赫氏培养基中，每种培养基上鼠疫菌的生长率应达到最低限制。生长率（P_R）的计算：P_R=N₅/N₀，N5为从一个或多个待测培养基平板上培养到的菌落总数；N₀为从一个或多个规定的参考培养基平板上培养到的菌落总数（该菌落总数应≥100 cfu）。采用划线法观察。

3.5 透明度

目测液体培养基应澄清，固体培养基应无絮状物或沉淀。

3.6 凝胶强度

手感适宜，用接种环划线时以培养基不被划破为宜。

3.7 培养基储存

定期对储存的培养基进行常规检查，若培养基发生结块、颜色异常或其他变质现象等不宜再使用。

4 赫氏培养基基础液成分优化

赫氏培养基是否适合鼠疫菌的培养、分离和鉴定，是鼠疫菌检验的重要环节。培养基的制备非常关键，可为鼠疫菌生长繁殖提供各种养分、适宜的酸碱度、合适的渗透压及足够的营养水分。

4.1 基础液的成分优化

国内鼠疫细菌培养用的培养基基础液有肉浸液琼脂和赫氏消化液琼脂培养基，其中以赫氏消化液琼脂培养基为优，在鼠疫菌检验中发挥着重要作用。

4.2 基础液所用肉质的筛选

在制备赫氏消化液时，所用肉质为牛肉，而牛肉又分牦牛肉和黄牛肉，将两种牛肉按常规法^[8]制备成赫氏消化液对其进行外观检查，发现差别较大，牦牛肉制成的消化液颜色发黑，上清液透明；而黄牛肉制成的消化液颜色发黄，消化液浑浊，上清液不透明。并对同种方法两种牛肉制成的两种消化液（牦牛肉、黄牛肉）按索恩森-格夫立洛夫氏测定法对其氨基氮含量进行测定，结果发现，牦牛肉制成的消化液其氨基氮含量为800 mg/L，在鼠疫菌生长所需的氨基氮含量范围内（500～800 mg/L或更高），黄牛肉制成的消化液其氨基氮含量为400 mg/L左右，未达到鼠疫菌生长所需的氨基氮含量范围。制备的两种消化液按照每100 ml培养基内含75 mg氨基氮的比例，用蒸馏水稀释上述消化液，并于其中加入氯化钠使其浓度达0.3%，磷酸氢二钠达0.1%，琼脂达2%，加热溶解校正pH值至7.0，灭菌后倒平皿制成胰酶消化液琼脂培养基^[8]。按常规稀释法将鼠疫菌稀释至1 000 cfu/ml，取制备好的两种基础液制成的培养基平皿各50个分别接种鼠疫菌悬液0.1 ml，用L棒涂抹均匀，置28 ℃培养48 h，经t检验，两种消化液制备的培养基活菌计数差异有统计学意义。从以上结果可知，牦牛肉优于黄牛肉，因此，制备赫氏消化液应尽量选择氨基氮含量高的牛肉。

4.3 最佳氨基氮含量的选择

用于鼠疫菌分离、纯化、判定的基础培养基为赫氏消化液，其氨基氮含量在700～1 000 mg/L。每100 ml培养基内含75 mg氨基氮的比例，可确保鼠疫菌良好生长。但氨基氮含量多少才是鼠疫菌最适生长的温床，国内外未曾报道。为此，通过6种不同氨基氮含量消化液（120、150、170、200、250、300 mg/L）制成的赫氏培养基，通过反复实验发现，氨基氮含量为170 mg/L的赫氏培养基优于其他5种氨基氮含量培养基，且差异有统计学意义（P＜0.05）。

4.4 最佳添加剂的筛选

若单独依靠普通琼脂培养基从含菌稀少的材料（特别是腐败材料）中分离鼠疫菌非常困难，必须采用优质培养基^[9]，如对鼠疫菌有刺激作用的赫氏敏感培养基。为此，选择3种不同的添加剂（2.5%亚硫酸钠、10%脱纤维兔溶血、0.2%硫酸亚铁）分别加入到赫氏普通培养基中测定活菌数，以观察其对鼠疫菌生长的刺激作用。结果表明，10%脱纤维兔溶血优于2.5%亚硫酸钠和0.2%硫酸亚铁，差异有统计学意义（P＜0.05）。因此，鼠疫菌培养基用10%脱纤维兔溶血作为理想的刺激剂，由其制备出的赫氏培养基对鼠疫菌的生长作用优于其他2种添加剂。

5 结 语

鼠疫菌赫氏培养基用于鼠疫菌的分离及保存，由于其含有较为丰富的碳水化合物、氮物质、无机盐、维生素和水等鼠疫菌生长的必要因子，在鼠疫菌检验中发挥着重要作用^[10]。通过对赫氏培养基基础液所用材料、氨基氮含量、制备培养基所涉及的影响因素、质量控制等进行研究，尤其对制备赫氏培养基进行的一系列优化筛选，发现基础液所选牛肉为牦牛肉，鼠疫菌生长的最佳氨基氮含量为170 mg/L，赫氏敏感培养基所用最适添加剂为10%脱纤维兔溶血。因此，加强培养基实验室质量控制，不断提高培养基的质控水平，对其制备的诸因素进行筛选，优化组合，可为鼠疫菌检测工作提供优质的培养基。