乙酰胆碱酯酶基因突变与蚊虫抗药性关系的研究进展
  中国媒介生物学及控制杂志  2017, Vol. 28 Issue (6): 608-611

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陆靖, 程鹏, 公茂庆, 沈波, 朱昌亮, 崔文, 谭文彬
LU Jing, CHENG Peng, GONG Mao-qing, SHEN Bo, ZHU Chang-liang, CUI Wen, TAN Wen-bin
乙酰胆碱酯酶基因突变与蚊虫抗药性关系的研究进展
Advances in studies of acetylcholinesterase gene mutations associated with insecticide resistance in mosquitoes
中国媒介生物学及控制杂志, 2017, 28(6): 608-611
Chin J Vector Biol & Control, 2017, 28(6): 608-611
10.11853/j.issn.1003.8280.2017.06.026

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收稿日期: 2017-06-25
网络出版时间: 2017-10-10 14:00
乙酰胆碱酯酶基因突变与蚊虫抗药性关系的研究进展
陆靖1, 程鹏2, 公茂庆2, 沈波3, 朱昌亮3, 崔文4, 谭文彬5     
1 济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院, 济南 250001;
2 山东省寄生虫病防治研究所, 山东 济宁 272033;
3 南京医科大学, 南京 211166;
4 济宁医学院司法鉴定中心, 山东 济宁 272067;
5 济宁医学院基础医学院, 山东 济宁 272067
摘要: 大量使用有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂可导致蚊虫产生显著抗药性。抗性产生的重要原因之一是乙酰胆碱酯酶(AChE)对杀虫剂的敏感性下降,而根本原因是AChE基因突变。该文对AChE基因的结构特点、功能、活性位点及AChE基因改变与蚊虫抗药性关系的研究进行归纳概述,并对蚊虫AChE基因研究前景进行分析和展望。
关键词: 蚊虫     抗药性     乙酰胆碱酯酶     基因突变    
Advances in studies of acetylcholinesterase gene mutations associated with insecticide resistance in mosquitoes
LU Jing1, CHENG Peng2, GONG Mao-qing2, SHEN Bo3, ZHU Chang-liang3, CUI Wen4, TAN Wen-bin5     
1 School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250001, Shandong Province, China;
2 Shandong Institute of Parasitic Diseases;
3 Nanjing Medical University;
4 Center of Forensic Science of Jining Medical University;
5 Academy of Basic Medicine, Jining Medical University
Supported by the Natural Science Foundation of China (No. 81271876, 81471985, 81672059), the Natural Science Foundation of Shandong Province of China (No. ZR2015YL023), Shandong Province Higher Educational Science and Technology Program (No. J13LK12), Program of Domestic Study for Young Scholar of University in Shandong Province Sponsored by Shandong Provincial Educational Department, and the Program for Scientific Research Innovation Team in Colleges and Universities of Shandong Province
Corresponding author: TAN Wen-bin, Email: 1392144@163.com
Abstract: Intensive use of organophosphate and carbamate insecticides has led to the development of resistance in mosquitoes. Acetylcholinesterase (AChE)insensitivity to organophosphate and carbamate insecticides has been identified as a major resistance mechanism in mosquitoes. This paper reviewed the progress of AChE gene mutations associated with insecticide resistance in mosquitoes. The AChE structure characteristics, the functional sites of AChE genes and the effect of mutation on insecticide resistance were detailed. Finally, the prospects in the studies of mosquito AChE were analyzed.
Key words: Mosquitoes     Insecticide resistance     Acetylcholinesterase     Gene mutation    

虫媒传染病严重危害人类健康,据统计,半数以上传染病由媒介生物传播。随着国际化交流增多,已被消灭的虫媒传染病死灰复燃,而新的虫媒传染病也接踵而至。蚊虫作为多种虫媒疾病的传播媒介,是医学界重点防控的昆虫之一。控制蚊虫是我国蚊媒传染病防治的重要环节,化学防治因见效快而成为主要防控手段。随着对杀虫剂的过度依赖及长期滥用,导致蚊虫抗药性的产生[1-2]。蚊虫产生抗性的机制主要为靶标抗性、代谢抗性、行为抗性和表皮抗性[3]。而杀虫剂的普遍使用所引起的抗药性可遗传[4],故要彻底解决蚊虫抗药性问题应从基因方面着手。乙酰胆碱酯酶(AChE)作为有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂的作用靶标,靶标敏感度下降是蚊虫抗药性产生的重要机制[5]。大量实验表明,AChE碱基替换和排列顺序的改变降低了酶的水解效率,这是不敏感AChE对杀虫剂产生抗性的主要原因。有研究认为,因AChE数量的增加及其蛋白质多态性丢失而产生抗性。现对蚊虫抗药性相关AChE的研究进展进行综述。

1 AChE的结构和作用机制

AChE是生物体内重要的神经酶类,主要生理功能为催化神经传导介质乙酰胆碱(ACh)的积累。作为抗性作用靶标的AChE,其活性部位与杀虫剂可快速不可逆地结合从而抑制酶活性。ACh水解无法正常进行,大量AChE积聚在突触处引起去极化的中断,神经传导无法完成,生物体丧失正常的生理功能。1986年首次从电鳐中拷贝了AChE的cDNA[6],1991年首次对电鳐的AChE晶体结构进行解析[7]。随着基因提取、分子克隆、基因转录、测序和原位杂交等分子生物学技术的快速发展,对AChE的结构和功能有了更深层次的认识。X-ray晶体衍射得到蚊虫AChE的立体结构,其分子表面有1个长约2 nm的深而窄的峡谷,谷内表面的60%是由14个高度保守的疏水性芳香族氨基酸残基组成[8](F120、288、290、330、331、W84、233、279、432和Y70、121、130、334、442)。三维结构显示,谷内包含由3个重要区域组成的AChE的活性中心:①催化三联体:由组氨酸、谷氨酸和丝氨酸残基组成AChE的活性中心,同时也是抑制剂的键结合位点;②外周阴离子位点(PAS):主要由酪氨酸、色氨酸和天冬氨酸等一些带负电荷的氨基酸组成,是其催化水解的第一步。当ACh达到最适浓度值时,ACh与PAS结合,催化水解过程[8],而ACh浓度过高时,水解反应受抑制;③乙酰化口袋:由苯丙氨酸、甘氨酸和色氨酸残基组成,具有一定的乙酰化活性。氨基酸残基借助其芳环侧链向球形分子表面形成的凹陷底部延展,使活性中心的空间缩小,致使大结构的底物或配体分子无法进入活性中心;④氧阴离子洞:由甘氨酸和丙氨酸残基通过N-H键而合成。目前,在埃及伊蚊(Aedes aegypti)、尖音库蚊(Culex pipiens)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)和三带喙库蚊(Cx. tritaeniorhynchus)等抗性品系AChE中发现氨基酸突变大多位于酶的活性位点附近。

2 AChE底物抑制、激活与抗药性的关系

底物专一性指酶对底物及其催化反应的严格选择性,一种酶只对一种或一类底物起催化作用。蚊虫AChE也具有底物专一性,且不同蚊种间有明显差别[9-11]。AChE作为ACh和乙酰硫代胆碱(ATCh)的水解酶具有高浓度底物抑制现象。Cohen等[12]和Bourne等[13]认为AChE的这种特性与复合物形成有关,而PAS参与该复合物的形成。Vellom等[14]和Barak等[15]发现PAS或其临近部位氨基酸残基结构的改变与底物抑制现象有关。Djogbénou等[16]在PAS发现3个突变位点,即在Toumbokro2b个体中位置24处的Gly至Ser、Bohicon72a个体中Asn至位置140处的Ser,Niamoue19个体中Asp至Val位置189处的Asp。这些致突变的氨基酸不具有酶原有的催化功能。另有研究发现,乙酰化口袋苯丙氨酸残基发生点突变后,AChE的催化活性由底物抑制转换为底物激活[6, 17],证明复合体的形成与氨基酸的改变均导致AChE出现底物抑制现象,进而对杀虫剂表现出不同的抗药性。

3 蚊虫AChE基因相关研究 3.1 蚊虫AChE的基因结构

1986年Hall和Spierer[6]首次从黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中拷贝AChE的cDNA。之后有研究从蚊等多类生物体内获得AChE的cDNA。蚊虫ace的转录本因蚊种差异而形式多样、大小各异,但可调控遗传信息表达的编码区序列大多约2 kb。Liu等[18]通过对埃及伊蚊ace的研究发现,其转录产物虽高达10 kb,但其遗传信息调控区序列约2 kb。不同生物体AChE的cDNA编码的多肽链虽同源性较高,但有所差别,主要在于编码AChE的羧基端是否含有疏水结构域及其催化亚单位二硫键与类胶原亚单位两者的连接方式不同,使不同生物中AChE有多种分子形式。AChE分子在同一生物中存在不同形式,原因如下:①单个AChE基因转录形成的mRNA拼接形式存在差异;②mRNA翻译后酶蛋白的修饰方式存在差异;③锚定蛋白基因所编码的产物存在协同作用[6]。Djogbénou等[16]研究揭示冈比亚按蚊AChE有两种分子形式,目前被认为是S和M分类群。且实验数据表明,G119S突变是一个独立事件,可能以一种形式发生并在另一种形式中渗透。蚊虫AChE启动子的结构因蚊虫种类不同而有所差异,埃及伊蚊的该基因启动子CAAT或TATA框缺失,但存在基因调控序列TCAGT,Cherbas和Cherbas[19]认为AChE编码基因表达的启动离不开该序列的调控。

3.2 编码AChE的基因类型

AChE基因中ace基因的数量在不同昆虫种类中存在差异,如线虫有4种分别位于不同染色体上的AChE基因。Weill等[20]认为大多数昆虫AChE为双基因编码,在种群进化过程中可能会有ace基因丢失。淡色库蚊AChE为双基因编码,位于常染色体上与抗性有关的ace1编码AChE1,位于性染色体上与抗性相关性小的ace2编码AChE2[21]。冈比亚按蚊同样为双基因编码,且序列比对发现ace1ace2的序列同源性为53%[22]。AChE的两种基因AChE1和AChE2分别有ace1ace2编码,后者多出含有31个氨基酸组成的肽片段,该片段具有良好的亲水性[23]ace基因的功能在生物中也不尽相同,主要归因于生物的ace基因内含子及外显子结构和数目不同。

3.3 蚊虫AChE基因多态性分析

Djogbénou等[16]研究揭示冈比亚按蚊AChE的两种分子形式存在共享基因多态性,ace-1基因中G119S突变是其中1种共享的基因多态性。研究表明,一些蚊虫携带3种不同的ace-1等位基因(1个抗性和2个不同的易感等位基因)均位于同一条染色体上,共享1个基因序列。Djogbénou等[16]ace-1基因的多态性进行分析,分别对15个M型和18个S型个体的敏感及抗性ace-1等位基因进行测序,74个位置分别显示了外显子2、内含子2、外显子3、内含子3和外显子4中3、10、34、20和7多个多态性位点。Essandoh等[24]同时发现An. coluzzi和冈比亚按蚊对杀虫剂表现出不同的抗性水平,前者明显高于后者,认为该差异的主要原因与目标基因多态性相关。而目标基因多态性产生的本质是基因的改变,如单个碱基的替换、缺失和插入及某段拷贝数的变化。

3.4 AChE基因的转录和表达

AChE基因的转录和表达与蚊虫抗药性的发生有直接联系[25-26],大量研究表明,ace的异常转录和表达使蚊虫体内AChE的量产生差异,高表达将导致抗药性的暴发。在蚊虫群体中,预先存在低水平的抗性基因,在杀虫剂的抗性筛选下抗性基因转录或表达水平升高,在蚊虫中抗性基因的频率逐渐上升,最终产生抗性。Labbé等[27]认为ace-1等位基因转录水平的升高使蚊虫抗性进化成为可能,抗性进化是基因突变、阳性选择和现有变异重排等共同作用的结果。埃及伊蚊成蚊的mRNA有3个主要AChE转录本,其大小存在明显差异(<4 kb和>10 kb)。在埃及伊蚊蛹和幼虫中仅有1个>10 kb的转录本,说明在蚊虫发育的不同阶段ace的转录可被调控[28]

4 AChE基因突变与蚊虫抗药性的关系

基因突变是指在杀虫剂抗性筛选下,蚊虫某些基因结构上发生碱基替换或排列顺序的改变(如ace碱基),导致其编码的基因产物对杀虫剂的敏感性下降而产生不同水平的抗性[29]。蚊虫对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂有两种不同抗性类型,即对有机磷高抗和对氨基甲酸酯同抗或相对低抗,对有机磷低抗和对氨基甲酸酯相对高抗[30],目前研究发现,因蚊虫的靶标部位敏感度降低产生的抗性多为后者。1964年Smissaert[31]发现二斑叶螨(Tetranychus urticae)敏感菌株体外AChE活性是抗性菌株的3倍,并对ace-1基因点突变赋予杀虫剂抗性进行首次报道。近年来,关于基因突变与杀虫剂抗性的关系研究主要集中在氨基酸的取代,认为其与蚊虫抗药性相关。

Alout等[32]和Nabeshima等[33]在AChE1催化位点发现3个取代基赋予有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂对该酶的不敏感性:(1)普遍发现的G119S取代:在非洲加纳南部,An. coluzzi和冈比亚按蚊对氨基甲酸酯类和有机磷类杀虫剂产生交互抗性。Essandoh等[24]发现ace1 G119S点突变与两种杀虫剂的抗性强烈相关。Edi等[34]报道该位点突变与杀螟硫磷和恶虫威抗性存在相关性。Feng等[35]对9种按蚊群体进行采样分析,证实ace-1中存在G119S突变。Weill等[21]比对尖音库蚊敏感株和残杀威抗性株的ace1基因编码区,揭示了G119S氨基酸替代,随后以同样方法陆续在多个蚊种的抗性种群中找到G119S氨基酸位点突变,如致倦库蚊(Cx. pipiens quinquefasciatus)、尖音库蚊和冈比亚按蚊。Liebman等[36]对秘鲁的淡色库蚊进行研究发现,G119S氨基酸取代第119密码子位点突变有时间顺序,第1个位点的突变发生在第2个位点突变之后,表明等位基因在淡色库蚊种群中以不可逆转的突变方向稳定向前移动,使抗性维持高水平。(2)仅在库蚊中发现的F290V取代和F331W取代及ace2基因中与Phe331同源位置的F445W取代[33]。(3)在埃及伊蚊中发现G105S、G285Y和F350Y[37]。Vaughan等[38]通过对埃及伊蚊AChE基因突变进行分析,揭示与有机磷抗性相关的F350Y和G285Y氨基酸取代及与氨基甲酸酯抗性相关的G285Y、F105S和F350Y氨基酸取代。(4)Zhao等[39]在我国南方地区收集了5种野生型抗DDVP和抗残杀威品系,发现5个碱基位置(V185M、G247S、A328S、A391T和T682A)的突变导致氨基酸取代。他对突变频率和抗性水平LC50进行相关性分析发现,T682A氨基酸取代与残杀威抗性呈负相关,V185M取代与DDVP、残杀威抗性无关。经Hardy-Weinberg Equilibrium(HWE)平衡检测,几种突变存在抗性相关,对抗药性的产生起协同作用。如GCC突变为TCC的A328S取代与GTG突变为ATG的V185M取代和GGC突变为AGC的G247S取代相关。HWE测试显示,与残杀威抗性相关的A328S、V185M和G247S氨基酸取代连锁出现,间接反映这3种类型的突变型在残杀威抗性的产生中起协同作用。Fournier和Mutero[40]及Menozzi等[41]对不同地区的几种抗性菌株进行ace基因克隆和测序发现,突变被分离或组合在相同蛋白质中,突变蛋白体外表达显示同一蛋白质中突变组合表现出高水平抗性,说明高水平抗性与存在于种群中有差异的抗性等位基因重组有关。通过定点诱变研究突变组合对抗性的影响研究发现,有两种作用类型:一方面通过突变组合增加抗性水平,另一方面通过组合降低抗性的特异性。综上所述,编码AChE基因不同位点的突变导致的氨基酸取代存在多种形式,不同氨基酸取代对不同种类杀虫剂产生不同水平的抗性,且氨基酸取代可以单独或通过连锁对杀虫剂抗性起协同作用,突变组合增加抗性水平的同时也能降低抗性的特异性。

5 展望

杀虫剂通过抑制AChE水解ACh,导致ACh在突触处积累,从而终止胆碱能突触中的神经冲动并最终导致生物体死亡[42]。杀虫剂抗性研究是蚊虫防制的重中之重,虽已制定较多合理的防控策略,但现场难以得到满意效果。Alout等[43]提出基于抑制剂新概念策略,通过筛选G119S突变的AChE1的抑制剂验证了该防制策略的可行性,为制定抗性传播的可持续战略提供了科学依据,从而确立了蚊虫抗药性管理的新前景。

随着杀虫剂的长期滥用,蚊虫抗药性问题日趋严峻,研究蚊虫抗药性机制迫在眉睫,虽已取得一定进展,但蚊虫种类多、分布广,生理形态等特性复杂多样,不同种类、不同地域间抗药性机制存在差异,故仍需不断完善。随着生物科技的发展,新的研究方法和技术的不断跟进,以及多学科的相互渗透,相信对AChE的结构特征、催化机制和抗性机制等将有更透彻的理解,为蚊虫防控工作带来新曙光。

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