基于分子生物学技术的吸血节肢动物血餐宿主鉴定方法研究概述
  中国媒介生物学及控制杂志  2017, Vol. 28 Issue (6): 603-607

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刘营, 孙继民, 凌锋, 卢苗贵, 施旭光, 任江萍, 张蓉, 陈恩富
LIU Ying, SUN Ji-min, LING Feng, LU Miao-gui, SHI Xu-guang, REN Jiang-ping, ZHANG Rong, CHEN En-fu
基于分子生物学技术的吸血节肢动物血餐宿主鉴定方法研究概述
Study of identification methods for arthropod bloodmeal donor based on molecular biology
中国媒介生物学及控制杂志, 2017, 28(6): 603-607
Chin J Vector Biol & Control, 2017, 28(6): 603-607
10.11853/j.issn.1003.8280.2017.06.025

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收稿日期: 2017-06-15
网络出版时间: 2017-10-10 13:59
基于分子生物学技术的吸血节肢动物血餐宿主鉴定方法研究概述
刘营, 孙继民, 凌锋, 卢苗贵, 施旭光, 任江萍, 张蓉, 陈恩富     
浙江省疾病预防控制中心传染病预防控制所, 杭州 310051
摘要: 吸血节肢动物作为虫媒传染病的重要传播媒介,其宿主的确定对理解虫媒传染病生态学及采取进一步的防控措施具有重要意义。血餐鉴定策略是识别节肢动物宿主的有效方法,随着分子生物学技术的发展,DNA检测方法提高了吸血节肢动物血餐鉴定的特异性和敏感性,常用的分子生物学方法有PCR、DNA序列测定、异源双链分析、限制性片段长度多态性分析、反向线点杂交技术和DNA指纹图谱等。通过对分子生物学技术在节肢动物血餐宿主研究中的原理及优缺点进行综述,以期为相关虫媒疾病防控提供参考。
关键词: 聚合酶链式反应     基因扩增测序     反向线点杂交     节肢动物     血餐    
Study of identification methods for arthropod bloodmeal donor based on molecular biology
LIU Ying, SUN Ji-min, LING Feng, LU Miao-gui, SHI Xu-guang, REN Jiang-ping, ZHANG Rong, CHEN En-fu     
Zhejiang Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310051, Zhejiang Province, China
Supported by the Medicine and Health Science and Technology Plan Project of Zhejiang Province (No. 2017KY291)
Corresponding author: CHEN En-fu, Email: enfchen@cdc.zj.cn
Abstract: Hematophagous arthropods are important vectors for vector-borne diseases. The identification of hematophagous arthropods'hosts is critical to exploration of vector-borne disease ecology and further control measures. The strategy of bloodmeal identification is effective to ascertain arthropod hosts. With the development of molecular biology technology, DNA-based methods, which include PCR, DNA sequencing, restriction fragment length polymorphism, reverse line blot hybridization, and DNA fingerprinting, enhanced the specificity and sensitivity of hematophagous arthropod bloodmeal identification greatly. This paper reviewed the principles, advantages and disadvantages of molecular protocols for detection of host DNA, which might help to provide reference for the prevention and control of related vector-borne diseases.
Key words: Polymerase chain reaction     DNA sequencing     Reverse line blot hybridization     Arthropods     Bloodmeal    

我国丰富的气候条件、地理景观和生态环境孕育了多样性的病原、宿主动物和病媒生物,导致病媒传播疾病广泛分布和频繁发生,在我国法定报告传染病中约1/3的疾病是由病媒生物作为媒介传播的[1-2]。吸血节肢动物作为重要的病媒生物,在其叮咬宿主获取血餐的过程中可传播多种病原体(如病毒、立克次体、细菌、螺旋体和原虫等),并可引起人森林脑炎、肾综合征出血热、莱姆病、疟疾、登革热、发热伴血小板减少综合征等自然疫源性疾病[3-4]。吸血节肢动物血餐宿主的确定对了解病原体在自然界的保持和循环,如确定贮存宿主、理解病原体-媒介-宿主的交互作用以及采取相应的控制措施或评价媒介控制措施的效果等具有重要的参考价值[5-7]

历史上节肢动物血餐宿主鉴定常采用血清学方法,如环状沉淀试验、免疫扩散试验、ELISA等,血清学试验在血餐宿主研究中也提供大量数据和线索,但也存在很大局限性:要求血餐相对新鲜、量较大;相近物种间易产生抗体交叉反应,呈现假阳性结果,血餐宿主鉴定水平通常只能达到目或科等较高分类阶元,特异性较差;需预先制备待查宿主动物的抗血清,耗时长、操作复杂,无法鉴定未知的潜在宿主[6-8]

随着分子生物学技术的发展,基于线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)、核基因及核糖体基因序列差异的DNA检测方法提高了吸血节肢动物血餐鉴定的特异性和敏感性,血餐宿主鉴定提高到种,甚至是个体水平,许多节肢动物的吸血行为被重新认定[6]。常用的分子生物学方法有特异性PCR、实时荧光PCR(Real-time PCR)、DNA序列测定、限制性片段长度多态性分析、异源双链分析、反向线点杂交技术和DNA指纹图谱等[6, 9]。现就分子生物学技术在节肢动物血餐宿主研究中的原理及应用进行综述,以期为相关虫媒传染病防控提供参考。

1 PCR

基于PCR方法的蚊虫、锥蝽、蜱、库蠓属等节肢动物血餐宿主鉴定已有报道,PCR技术的敏感性和特异性均高于血清学方法,尤其建立的可针对不同物种的特异性多重PCR,因具有价廉、快速等特点有巨大的潜在应用价值,国内外对此开展过较多研究[10-14]。线粒体细胞色素b(cytochrome b,Cytb)基因是常用的分子标志,根据血餐宿主物种间Cytb基因序列的差异设计特异性引物,使该引物只能在特定的血餐宿主中扩增出特定长度的片段,通过扩增片段的有无鉴定节肢动物胃血来源,如Ngo和Kramer[15]通过设计的5种目水平特异性引物成功区分了饱血蚊胃血样本中的哺乳动物血餐以及4种鸟源血餐[16]。Kirstein和Gray[17]在实验室条件下让蓖子硬蜱(Ixodes ricinus)幼蜱叮咬小鼠,以Cytb基因作为诊断标记,通过普通PCR可有效扩增饱血后10 d内宿主靶基因,但进一步设计的巢式PCR则可将鉴定时间延长到蓖子硬蜱饱血后200 d。在各物种特异性引物建立的基础上,一些研究者开始探索通过多重PCR方法实现节肢动物多宿主的混合血餐检测。Garros等[18]设计了7种家畜和3种野生动物种水平特异性引物,应用多重PCR方法对饱血库蠓属昆虫的多食性进行了研究。张井巍等[19]在研究传疟媒介按蚊的嗜血习性时,针对犬、猪、牛、人的mtDNA Cytb设计了特异性引物,应用多重PCR法对云南省部分地区按蚊胃血标本进行鉴定,结果显示该法能较好地鉴定现场捕获的按蚊胃血源。与普通PCR比较,Real-time PCR在血餐宿主鉴定中具有较高灵敏度,对于因消化或储存导致部分降解的血餐标本也能较好地鉴定;操作相对简便,不需对产物进行凝胶电泳,且闭管操作不易受污染等[9, 20-21]。Sales等[22]在研究白蛉亚科血餐时,以犬、猫、马、鸡、黑鼠和人线粒体Cytb基因保守区为靶区域,建立的Real-time PCR检出限可达0.1~10.0 pg DNA。为进一步提高该方法的检测效率,Woods等[23]使用多色荧光标记建立多重实时荧光定量PCR应用于猫栉首蚤(Ctenocephalides felis)血餐宿主的研究中,而且该方法检测灵敏度较高(4.5~450.0 fg样本DNA)[24]

基于PCR方法在研究吸血节肢动物特定血餐宿主时可作为很好的选择,可以实现一次扩增即能判定血餐样本是否属于目标物种,具有检测灵敏度较高、特异性好、检测效率高、操作简便和出结果快的优势。但多重PCR条件优化难度大,需设计潜在血餐宿主的特异性引物,在血餐宿主鉴定中适用范围受限,同时对于未知的血餐宿主难以鉴定[22]

2 基因扩增测序

基因扩增测序技术是节肢动物血餐宿主鉴定中最直接、特异的方法。该方法先利用通用引物对血餐中宿主残留靶基因进行扩增,然后进行测序,并将其序列在基因库中进行同源性比对或系统进化分析,进而鉴别血餐来源于何种动物。Pierce等[25]通过巢式PCR扩增了反刍动物mtDNA Cytb基因并进行序列测定,进而鉴定美洲花蜱(Amblyomma americanum)的吸血动物(反刍动物)来源。Graham等[26]为提高基因扩增测序技术的灵敏度,以线粒体12S rRNA基因为诊断标记,应用实时荧光定量PCR扩增结合测序方法鉴定蚤中脊椎动物血餐,该方法结合了实时荧光定量PCR的灵敏性和测序技术的特异性使得蚤血餐宿主鉴定部分达到种水平。Logue等[27]分别以哺乳动物16S rRNA基因和人mtDNA高变区Ⅰ作为诊断标记,应用高通量测序方法对巴布亚新几内亚部分地区捕获的疟蚊血餐进行鉴定,结果显示哺乳动物中人、猪、犬为当地疟蚊的主要宿主,16.3%的蚊胃血标本为混合血餐,且人源血餐中4.9%取食于不同个体。Hebert等[28]2003年首次提出了以线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome C oxidase subunitⅠ,COⅠ)为主要诊断标记,利用通用引物扩增待测物种的mtDNA COⅠ基因片段,并将目的序列和生命DNA条形码数据库中的参考序列进行比对分析,可实现快速准确的物种鉴定及新种识别,即DNA条形码技术(DNA barcoding)[29],该技术在节肢动物血餐宿主鉴定中被证明行之有效,Alcaide等[30]、Gariepy等[31]已用该方法鉴定了蜱脊椎动物宿主。

基因扩增测序技术在血餐宿主鉴定中具有特异性高的优点,尤其在探求未知宿主及鉴定多宿主来源血餐上具有明显优势,鉴定的特异性可达个体水平。但对部分降解、残留DNA量较少的血餐样本的鉴定其灵敏度还有待提高;对于混合血餐,通常需对基因扩增产物进行克隆后测序;相比其他方法基因测序费用也较高,不适用于大规模血餐样本的鉴定[6, 32-33]

3 异源双链分析(heteroduplex analysis, HDA)

HDA因在基因突变检测中具有高灵敏度,常被用于遗传筛查,因其可发现DNA序列中的微小差异,在近缘物种的鉴定中具有一定优势[34]。HDA用于节肢动物血餐宿主鉴定的主要原理是基于DNA分子的变性、复性过程,首先在PCR中采用同一对引物,选取具有一定同源性的目的片段作为异源双链驱动子(driver)与血餐宿主相应靶基因进行混合,从不同来源扩增得到的DNA片段经变性、复性后形成同源、异源双链,因异源双链中碱基错配或不配导致分子构象发生改变,在非变性PAGE中相同长度(也可稍有差别)的同源和异源双链在凝胶中的迁移率不同,且异源双链同源性越高泳动越快,通过与待查宿主及驱动子形成的异源双链参照图谱比较从而达到鉴定目的[35-37]。1999年Boakye等[34]首次应用PCR-HDA方法开展了黑蝇(Simulium damnosum s. l.)、舌蝇(Glossina palpalis)的血餐宿主研究,其脊椎动物宿主鉴定分类单元达到属水平。Lee等[37]在研究北美地区蚊属鸟源血餐时对该方法进行了优化使得鉴定分类单元提高到种水平。Bosseno等[10]将HDA与多重PCR结合起来研究墨西哥部分村庄锥蝽的吸血来源及克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)感染状况,该检测技术的联合应用可有效研究人感染途径以及克氏锥虫在自然界中的传播循环。HDA基于对凝胶图谱的解读,因多宿主混合血餐理论上会产生(N+1)2(N为血餐宿主种类)种同源或异源双链,使得鉴定更为复杂,Bosseno等[38]2009年在HDA基础上联合应用克隆测序方法对锥蝽多食性进行研究,使得混合血餐的鉴定有了相对经济有效的方法[35, 37]

HDA电泳图谱中出现参照图谱不能解释的谱带时,提示潜在的未知宿主存在,可通过进一步的DNA测序进行鉴定,并可将新谱带纳入参照图谱中以扩大可检测的宿主范围[34]。HDA在血餐宿主鉴定中也存在技术局限性,首先若探究节肢动物血餐宿主需制定大范围潜在宿主参照图谱;单纯使用HDA对大样本量和混合血餐的鉴定较为复杂;其灵敏度受碱基错配类型以及凝胶基质、厚度、缓冲液、电泳电压等实验条件影响,不同研究中可比性较差以至于无法创建通用的参照图谱库[10, 33, 39]

4 限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)

RFLP技术是在PCR和DNA序列分析基础上产生的,该方法首先通过PCR扩增血餐宿主目的基因,然后根据不同种间宿主动物靶基因序列信息的多态性选择合适的内切酶或内切酶组合酶解样品DNA,从而得到大量的限制性酶切片段,经凝胶电泳后根据种属特异性的酶切图谱达到物种鉴定目的[6]。目前已有应用PCR-RFLP方法鉴定硬蜱、舌蝇、按蚊、锥蝽血餐宿主的报道,在这些研究中常用的目的基因有mtDNA Cytb12S rRNA16S rRNA基因等[17, 40-42]。Kirstein和Gray[17]通过对小家鼠(Mus musculus)、绵羊(Ovis aries)、黇鹿(Dama dama)和家牛(Bos taurus)4种动物mtDNA Cytb基因的种特异性酶切位点多态性分析,筛选出HaeⅢ+DdeⅠ的内切酶组合,可分辨出隶属于7科(鼠、犬、牛、仓鼠、兔、鹿和雉科)11种动物中的10种(鹿科的马鹿和梅花鹿无法鉴定),肯定了RFLP技术在血餐宿主鉴定中的潜在应用价值。Oshaghi等[41]在斯氏按蚊(Anopheles stephensi)血餐研究中基于Cytb基因酶切多态性,选取XhoⅠ和TaqⅠ内切酶对斯氏按蚊潜在宿主人、牛、绵羊、鸡和豚鼠进行了鉴定,认为Cytb基因能够表现出足够的种间多态性,若针对特异性的人mtDNA高突变区进行扩增,也可使节肢动物血餐宿主鉴定达到个体水平。Roellig等[40]通过特异性扩增哺乳动物残留DNA,应用该技术对美洲锥虫病传播媒介锥蝽的多宿主混合血餐进行了鉴定。

RFLP技术具有简便、经济等优点,而且由于限制性内切酶识别序列具有专一性,因此具有较高的可靠性。但在目的片段含有的可显示种属间差别的酶切位点并不多、可提供的多态性信息量有限的情况下,不得不选择多种限制性内切酶,这不仅耗时和成本显著提高,而且还使操作变得繁琐及增加污染和错误的概率[43-44]

末端限制性片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)技术的基本反应原理与RFLP相似,不同之处在于使用了荧光标记PCR产物[45]。Meece等[33]通过荧光标记引物扩增69种(55种鸟类、13种哺乳类和1种两栖类)动物一段长为358 bp的Cytb片段,基于可检索数据库成功鉴定了50只蚊胃血餐来源。T-RFLP的优点在于重复性好,高通量、自动化程度高,可与现有数据库进行对比。由于产生末端限制性片段的设备为DNA测序仪,所以精确度和分辨率较高,但与RFLP比较完成实验所需设备要求较高,试剂价格也较昂贵[42]

5 反向线点杂交(reverse line blot hybridization, RLB)

RLB是一种将PCR、核酸杂交、光化学反应三者融为一体并可用于大样本、多通道的生物芯片诊断技术[46-47]。在节肢动物宿主鉴定中,它采用多位点固化了已知物种特异性寡核苷酸探针的膜条与扩增的血餐宿主靶序列杂交,经光化学反应(生物素-标记酶的亲和素-显色剂)通过不同位置的杂交信号进行鉴定,具有良好的敏感性、特异性,且操作简单、成本低廉以及结果易判读等特点[46-48]。有些研究人员已用该方法成功地鉴定了欧洲蓖子硬蜱及北美美洲花蜱(Amblyomma americanum)的血餐宿主[49-51]。Kirstein和Gray[17]以长95 bp的Cytb基因片段作为诊断标记,设计了小家鼠、绵羊、黇鹿和家牛物种特异性探针并选取叮咬小家鼠的蜱作为研究对象,验证了RLB技术在蓖子硬蜱血餐宿主鉴定中的特异性可达种水平。Pichon等[12, 51]对该方法进行了改进,选取较为保守的18S rRNA基因作为诊断标记,设计的引物扩大了可扩增的宿主范围,对游离蓖子硬蜱的病原体和宿主DNA进行了鉴定,特异性到鸟类的目、啮齿类的属级、反刍亚目水平,集中鉴定了几十个不同的脊椎动物分类单元和病原体。Moran等[50]、Humair等[52]两个研究组以12S rDNA作为诊断标记,在扩大了可扩增宿主范围的同时使蓖子硬蜱血餐宿主鉴定的特异性提高到种、属水平。Abbasi等[8]选取Cytb基因作为诊断标记对白蛉血餐宿主进行鉴定,认为RLB技术比RFLP和DNA扩增测序技术的灵敏度高,对于潜在宿主种类有限的环境(如人栖环境、干旱地区)适合应用RLB技术进行节肢动物血餐宿主鉴定。但对宿主范围较广,需设计大量的物种特异性探针,并且需要根据实际情况对杂交温度、时长、探针浓度和模板浓度等进行优化,有可能出现交叉杂交的现象[8, 53]。对于潜在宿主基因序列未知的情况也无法设计特异性探针,使得该方法在节肢动物血餐宿主探究中也存在一定的限制性。

6 其他方法

DNA指纹图谱(DNA fingerprinting)是建立在基因组小卫星或微卫星DNA分子标记基础之上的,基于分布广泛、高度多态的串联重复序列,所以在物种鉴定中其最大优点是可将分类单元提高到个体水平[54-56]。1985年Jefferys首先将DNA指纹技术应用于法医鉴定,1990年Coulson等[57]应用该技术研究了冈比亚按蚊(An. gambiae)人源血餐宿主,开启了利用DNA指纹图谱技术鉴定节肢动物血餐宿主的先河。Ansell等[58]对该方法进行了改良,选用5种人微卫星标志引物进行PCR扩增,产物经PAGE,结果直接由计算机自动分析、显示,减少了用放射自显影所需时间及目测条带所造成的误差。

蛋白质鉴定策略由于其高可靠和高效率而被广泛应用于蛋白质组学研究中[59],Wickramasekara等[60]基于蛋白质组学的质谱法鉴定了蜱血餐中残留的宿主特异性蛋白,该方法具有高灵敏度,但对设备的要求及费用也较高,而且目前还没有潜在宿主的特征蛋白库,对大范围宿主的研究可行性不高。

7 展望

基于分子生物学技术的血餐宿主鉴定方法的建立和应用在病媒传播疾病生态学及防控策略研究中具有较大的价值。国外就分子生物学技术在吸血节肢动物血餐宿主鉴定中已开展较多研究,而国内相关研究较少,仅局限于PCR技术在传疟蚊媒中的研究,且不同地区、不同生境条件下节肢动物宿主迥异,不能直接利用国外相关研究数据指导国内虫媒传染病防控,所以利用分子生物学方法研究节肢动物血餐宿主在我国具有广泛的应用前景。虽然不同方法在灵敏度、特异性、操作、费用、数据处理上各有优点,但也难以摒弃各自的局限性,如需要对其反应体系进行优化、所需仪器较昂贵以及对有些物种灵敏度不高等。随着分子生物学技术的发展,这些方法都结合了相应的技术来弥补自身的不足,如结合荧光技术提高灵敏度及检测效率,结合直接PCR缩短检测时间,结合DNA测序提高检测精准度等,检测技术的联合应用使得其在实际应用中发挥着重要作用。因此,在节肢动物血餐宿主鉴定实际应用中可根据研究目的及实验条件,综合选择适宜的方法,从而得到更准确可靠的鉴定结果。

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