河北省鼠疫自然疫源地宿主耶尔森菌存在形式初步调查
  中国媒介生物学及控制杂志  2017, Vol. 28 Issue (6): 586-588

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史献明, 杜国义, 尤殿平
SHI Xian-ming, DU Guo-yi, YOU Dian-ping
河北省鼠疫自然疫源地宿主耶尔森菌存在形式初步调查
Study on Yersinia-like bacteria in the plague natural foci of Hebei province
中国媒介生物学及控制杂志, 2017, 28(6): 586-588
Chin J Vector Biol & Control, 2017, 28(6): 586-588
10.11853/j.issn.1003.8280.2017.06.017

文章历史

收稿日期: 2017-08-21
网络出版时间: 2017-10-10 13:59
河北省鼠疫自然疫源地宿主耶尔森菌存在形式初步调查
史献明, 杜国义, 尤殿平     
河北省鼠疫防治所, 河北 张家口 075000
摘要: 目的 在鼠疫静息期,检测鼠疫自然疫源地宿主鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)同源菌或变异菌株。方法 2016年5-6月在河北省鼠疫自然疫源地康保牧场监测点,采用夹日法捕获长爪沙鼠,采用弓形夹法捕获达乌尔黄鼠,取各鼠的小肠和舌尖,分离耶尔森菌,进行形态学和生化鉴定、PCR鉴定其种类。结果 在363份标本中,93份为三糖铁琼脂试验阳性菌株,但PCR鉴定排除小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌。结论 在鼠疫自然疫源地静息期可能存在鼠疫菌的近缘菌,需要进一步鉴定三糖铁阳性菌株。
关键词: 耶尔森菌同源菌     鼠疫     鼠疫自然疫源地    
Study on Yersinia-like bacteria in the plague natural foci of Hebei province
SHI Xian-ming, DU Guo-yi, YOU Dian-ping     
Anti-plague Institute of Hebei Province, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China
Supported by the Key Medical Projects of Hebei Province in 2016 (No. 20170446) and National Major Research and Development Plan (No. 2016YFC1201304)
Corresponding author: DU Guo-yi, Email: dgyhbs@163.com
Abstract: Objective To detect the homologous bacteria or mutant strains of Yersinia pestis bubonic plague during the resting period of plague. Methods Meriones unguiculatus were captured by clamping method and Citellus dauricus were captured by bow clamp method in Kangbao rangeland monitoring station of the plague natural foci of Hebei province during May to June in 2016. The intestine and the tip of the tongue were sampled, and Jerson 's bacteria were isolated. Morphological and biochemical identification and PCR identification were carried out. Results In total 93 of 363 samples were found positive for strains of Y. pestis of TSI. But PCR did not validate it. Conclusion There were closely related bacteria to Y. pestis in the natural foci of plague. Further identification of three sugar iron positive strains is needed.
Key words: Yersinia-like bacteria     Plague     The plague natural foci    

耶尔森菌属(Yersinia)属于肠杆菌科,包括鼠疫耶尔森菌(Y. pestis,鼠疫菌)、小肠结肠炎耶尔森菌(Y. enterocolitica)和假结核耶尔森菌(Y. pseudotuberculosis)等菌种,其中鼠疫菌对人类危害最大,历史上曾引起3次鼠疫大流行,给人类带来巨大灾难[1]。我国有12类鼠疫自然疫源地,河北省鼠疫自然疫源地属于鄂尔多斯高原长爪沙鼠(Meriones unguiculatus)鼠疫自然疫源地,是我国鼠疫自然疫源地的一种。鼠疫作为自然疫源性疾病在近代虽未有大的人间疫情,但动物间鼠疫几乎每年发生。河北省1971年首次发现鼠疫菌,证实了河北省鼠疫自然疫源地的存在,之后的1971-1972、1984、1994-1995、2002-2003、2005年共发生5次动物间鼠疫,每隔约10年发生1次,在动物间鼠疫间歇期,鼠疫菌以何种形式保存及鼠疫自然疫源地内有无鼠疫菌的近缘菌,值得深入研究。

1 材料与方法 1.1 样本来源

2016年5-6月在河北省鼠疫自然疫源地康保牧场监测点,采用夹日法捕获长爪沙鼠,采用弓形夹法捕获达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus),每只鼠取小肠和舌尖各1 g,分别在研钵内研碎,加入盛有10 ml的耶尔森菌增菌液,4 ℃分别保存7、14和21 d,待检。

1.2 试剂

改良磷酸盐缓冲液(HB271,青岛海博生物技术有限公司);耶尔森菌选择性培养基、三糖铁培养基、尿素酶培养基(OXOID公司);氧化酶测定试剂盒(北京陆桥技术股份有限公司);扩增仪、电泳槽、琼脂糖凝胶电泳、电泳缓冲液、标准分子质量Marker。其他试剂实验室自备。

1.3 鉴定方法 1.3.1 分离培养

取1.1中菌液在耶尔森菌选择性培养基上28 ℃培养24 h;分别于7、14、21 d在耶尔森菌选择性培养基上28 ℃培养24 h。选取ϕ 1~2 mm、较小的湿润红色菌落。

1.3.2 生化鉴定

从选择性培养基上挑取3~5个可疑菌落进行生化鉴定。

1.3.2.1 糖分解试验

挑取可疑菌落接种于三糖铁琼脂斜面培养基,28 ℃培养24~48 h。挑选斜边或底层均变为黄色(A/A),不产生H2S,不产气菌株进一步鉴定。

1.3.2.2 尿素分解试验

刮取斜面上大量菌苔,浓厚接种于尿素培养基,振荡均匀,25 ℃培养24 h,变红色者为尿素酶阳性。

1.3.3 生物学鉴定

将可疑菌落按常规方法(煮沸法)提取DNA,进行毒力因子的鉴定。染色体源毒力基因:ail(黏附侵袭位点基因)、ystA(小肠结肠炎耶尔森菌耐热性肠毒素A基因)、ystB(主要为生物1A型小肠结肠炎耶尔森菌携带)。质粒(pYV)源毒力基因:yadA(黏附素)、viF(yop调节子的转录活化因子)。引物及扩增体系参照文献[2],扩增:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性15 s;退火30 s;72 ℃延伸30 s;25个循环;最后72 ℃延伸5 min。电泳:1.5%琼脂糖凝胶电泳;染色观察。

2 结果 2.1 样本采集

2016年5-6月在河北省鼠疫自然疫源地康保牧场监测点捕获长爪沙鼠198只,达乌尔黄鼠165只(表 1)。

表 1 2016年河北省康保牧场各监测点捕获鼠数量(只)
2.2 生化鉴定结果

363份样本经生化鉴定,其中93份样本三糖铁琼脂试验阳性,包括长爪沙鼠小肠样本56份和达乌尔黄鼠小肠样本37份,尿素酶试验均为阴性。可疑样本经分子生物学鉴定未扩增出小肠结肠炎耶尔森菌特异性毒力基因。

3 讨论

刘建芳和严延生[1]研究发现,在每次动物间鼠疫流行末期,鼠疫菌的毒力和生化特征等均会发生很大变化,即遗传物质发生变化,尤其是鼠疫菌质粒的变异最大。辛友全等[3]认为在每次动物间鼠疫流行末期,由于宿主密度的降低或其他环境因素发生变化,鼠疫菌的DNA也发生变化,致使变为其近缘菌而使动物间鼠疫流行终止。人类只是鼠疫流行过程中的偶然宿主,其流行规律不在其列。

鼠疫菌在自然界存在形式有内在说和外来说2种[4],但不排除鼠疫菌在鼠疫流行间歇期以变异菌株或小肠结肠炎耶尔森菌或假结核耶尔森菌形式存在。王鑫和景怀琦[5]认为耶尔森菌属(G+C)含量约为47%。假结核耶尔森菌与鼠疫菌在遗传学上非常相近,DNA同源性>90%。种系发生学研究认为,假结核耶尔森菌是鼠疫菌最近的先祖,并推断鼠疫菌是从血清O:1b型假结核耶尔森菌衍化而来。姚颖波等[6]研究发现耶尔森菌属中的鼠疫菌、小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌属于近缘菌,从生物进化和群体遗传学角度,比较鼠疫菌和假结核耶尔森菌的基因片段和历史上出现的3次世界范围的人间鼠疫大流行状况,发现鼠疫菌和假结核耶尔森菌在鼠疫的暴发期和间歇期交互出现,可能为同一菌种的2个亚种[7]。河北省鼠疫自然疫源地自发现以来共发生5次动物间鼠疫,间歇期约10年,最近一次流行在2005年,距今已间隔11年,在此期间是否有鼠疫菌变异菌株或其他2种同源菌,本研究于2016年5-6月在河北省鼠疫自然疫源地康保牧场各监测点采集主要宿主动物标本,进行细菌分离鉴定,经形态学、生物学和生化鉴定,发现形态学和生化阳性,三糖铁阳性结果说明在样本中肠道菌占有一定优势,虽未检测出鼠疫菌、小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌,但三糖铁阳性菌是否与鼠疫有关需进一步研究。本研究仅为初步探讨,可疑菌与鼠疫菌的关系值得进一步探索。

参考文献
[1]
刘建芳, 严延生. 鼠疫耶尔森菌的分子生物学研究进展[J]. 中国人兽共患病杂志, 2004, 20(11): 994-997. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2004.11.022
[2]
陈双艳, 郭英, 张海鹏, 等. 2013-2014年云南省剑川县野鼠鼠疫疫源地小肠结肠炎耶尔森菌的调查分析[J]. 疾病监测, 2016, 31(2): 141-144. DOI:10.3784/j.issn.1003-9961.2016.02.013
[3]
辛友全, 魏柏青, 杨晓艳, 等. 中国11个鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌质粒谱类型及其分布特征[J]. 中华预防医学杂志, 2015, 49(1): 9-12.
[4]
纪树立. 鼠疫[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1988, 207-209.
[5]
王鑫, 景怀琦. 假结核耶尔森菌研究进展[J]. 中国人兽共患病学报, 2007, 23(10): 1041-1046. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2007.10.023
[6]
姚颖波, 马伟泉, 陈连球, 等. 云南省新平县家鼠鼠疫疫源地小肠结肠炎耶尔森菌的调查分析[J]. 中国微生态学杂志, 2013, 25(10): 1123-1127.
[7]
Parkhill J, Wren BW, Thomson NR, et al. Genome sequence of Yersinia pestis, the causative agent of plague[J]. Nature, 2001, 413(6855): 523-527. DOI:10.1038/35097083