汉坦病毒（Hantavirus，HV）隶属布尼亚病毒科汉坦病毒属，是具有包膜分节段的单股负链RNA病毒，平均直径约为120 nm，基因组由L（Large）、M（Medium）和S（Small）3个片段组成^[1]。主要引起肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒肺综合征（HPS）^[2]，其中HFRS疫区多分布于亚欧大陆，HPS疫区多遍布在美洲地区^[3]。我国HFRS病例分布广泛，发病例数和死亡人数均居世界首位^[4]，对我国居民健康构成严重威胁^[5]。目前，HV至少有23个已确定的基因型和30多个暂定基因型^[6]，而我国主要以汉城型（SEO型）和汉滩型（HTN型）为主。河北省是HFRS高发省份之一，属于以SEO型占绝对优势的混合型疫区^[7]。近几年疫区分布呈现由中部地区（石家庄、沧州、衡水、保定市）向东北部地区（秦皇岛、唐山市）扩展的趋势。目前，河北省东北部地区病例占全省病例总数的80%以上，是河北省HFRS的主要疫区^[8-9]。2016年在河北省秦皇岛口岸进行医学媒介生物监测工作中，从1只褐家鼠（Rattus norvegicus）中检测到HV，为确定其基因型，本研究运用实时荧光PCR（Real-time PCR）、测序技术及构建系统进化树等方法对该病毒株S基因序列进行了分析。

本实验所用4只褐家鼠，于2016年7月28日由秦皇岛出入境检验检疫局采自渤海船务有限公司货堆区和生活区。

对捕获鼠进行分类鉴定，在无菌环境下剖取鼠肺组织，利用自动样品匀浆仪（MagNaLyser，Roche，Germany）均质鼠肺，并参照RNA提取试剂QIAamp^® Viral RNA Mini Kit试剂盒（德国Qiagen公司）使用说明书进行RNA提取，最后加入无RNA酶的去离子水60 μl溶解，置-80 ℃保存备用。

分别使用鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）、钩端螺旋体、立克次体、伯氏疏螺旋体、HV通用型及Ⅰ、Ⅱ分型核酸测定（荧光PCR法）试剂盒（上海之江生物科技股份有限公司）进行体系配制，并置ABI7500荧光定量PCR仪检测。

将阳性样品送至上海之江生物科技股份有限公司测序，测序结果在GenBank核酸数据库中进行比对，下载相关序列，使用DNAStar（version 5.01）软件进行核酸序列相似比较，Clustal X2.0^[10]与Mega 4.0^[11]软件进行多重序列比对并以邻位相连法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发生树。用bootstrap方法鉴定分支聚类的稳定性^[12]，分析采用1 000个多序列组（replicates）。

4个样品中鼠疫菌、钩端螺旋体、立克次体、伯氏疏螺旋体的检测结果均为阴性，而HV通用型及Ⅰ、Ⅱ分型核酸测定的扩增曲线显示，4个样品中有1个阳性^[2]（Hebei-qhd），且为Ⅱ型HV。阳性对照和阴性对照扩增结果正确。

测序结果显示，褐家鼠携带的HV S基因序列为575 bp^[3]，运用DNAStar软件对该病毒株与GenBank中HV进行相似性比较显示，与SEO型病毒的相似性在87.3%~97.9%之间，其中，与Rn19毒株的相似性最高（97.9%）。另外，该毒株与HTV型代表毒株76-118的相似性为52.6%，与其他类型HV的同源性也较低，均＜55%。基于S基因片段核苷酸序列构建系统进化树，由图 1可以看出，本研究病毒株与国内外SEO型病毒株汇聚在一个单元群，远离其他基因型HV。而且与从北京市褐家鼠体内分离的S3亚型病毒株AY627049在同一分支，进化上高度同源，即与SEO型S3亚型病毒亲缘关系最近。

图 1 基于本研究HV毒株与其他类型HV的S基因序列构建的系统进化树

图选项

秦皇岛市于1984年首次发现HFRS病例，之后每年均有病例报告，已成为河北省HFRS的主要疫区，近年来发病率又呈上升趋势^[13]。秦皇岛口岸位于秦皇岛市海港区，作为中国最大的能源输出港，也是我国主要对外贸易综合性国际港口之一。1991年一艘长期停靠在该港口的作业船上曾发生一次HFRS暴发流行^[14]。随后2006年在港口区域捕获的褐家鼠中发现携带HV，且达到高带病毒率水平，但并未对HV进行基因特征分析。

本研究运用Real-time PCR法对2016年7月采自秦皇岛口岸的褐家鼠体内的病原体进行检测，结果发现1只褐家鼠携带HV，分型检测Ⅱ型HV呈阳性，通过核酸序列同源性比较，与SEO型HV的同源性最高，确定该病毒株为SEO型HV，与秦皇岛市以SEO型HV为主的报道相一致^[13-15]，表明秦皇岛市HV基因型未发生变异。基于S基因构建系统进化树，结果显示，与来自辽宁省沈阳市褐家鼠的S3亚型病毒株（GenBank No.：GU592950Shenyang）亲缘关系最近，汇聚在同一分支。因此推断，秦皇岛口岸的该毒株为S3亚型。此检测结果符合秦皇岛市是以褐家鼠为主要宿主和传染源的HV疫区的情况^[15]。

近年来随着港口不断发展，每年人员境外旅游和贸易活动往来也逐渐频繁，因此，加强对该港口媒介传染病病原体的检测具有十分重要的意义。本研究为制定有针对性的HFRS预防控制措施提供了科学依据，今后应加强对港口工作人员和附近居民卫生健康的宣传教育，港口相关的防疫部门应针对褐家鼠的活动习性在其活动高峰月份之前做好防治措施，以控制HFRS的流行。本研究检测样本量较少，对秦皇岛港口HV种类检测仍需做进一步系统调查。