巴尔通体（Bartonella spp.）是营养要求苛刻的革兰染色阴性多形性球杆菌^[1]，其属于一个相对较大的分类群，目前包含超过30种巴尔通体，并且这其中有超过一半巴尔通体与啮齿类动物有关^[2]，不仅如此，研究者发现至少15种巴尔通体可导致人类疾病^[3]，Bartonella washoensis为其中之一，可引起人类的心肌炎和脑膜炎^[4-5]。同江口岸位于黑龙江省东北部的松花江与黑龙江汇流处右岸，与俄罗斯下列宁斯阔耶口岸仅一江之隔。2016年，本研究组在对同江口岸鼠类携带巴尔通体情况调查时，首次在花鼠脾脏中扩增出与B. washoensis同源性较高的RNA聚合酶β亚单位〔RNA polymerase beta subunit gene（rpoB），rpoB〕基因阳性片段，这也是黑龙江省可能存在B. washoensis的直接证据。

2016年6月，在黑龙江省同江口岸林缘地中，以夹夜法（晚放晨收）和鼠笼法捕获鼠类，装入已编号鼠袋带回实验室，依据其外部形态特征进行鉴定、分类，无菌操作取脾脏，放置于2 ml无菌离心管中，置于-80 ℃备用，并记录所有鼠类样本的登记编号、采集时间、地点、生境、种类、雌雄等背景资料。

将采集的脾脏样本置于冰上，向离心管内加入无菌不锈钢珠和400 μl无菌磷酸盐缓冲液（PBS），用组织研磨器研磨0.5~1 min（时间不宜过长），使组织匀浆。将匀浆液4 ℃，8 000×g离心1 min，弃上清，沉淀物用于核酸提取。DNA提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒〔天根生化科技（北京）有限公司生产〕，具体步骤按照说明书进行操作。

PCR反应体系50 μl，模板DNA加5 μl，10 μmol/L引物1 μl，Premix Taq DNA聚合酶（TaKaRa）25 μl，加去离子水至50 μl。利用巴尔通体rpoB基因序列引物对所有样本进行特性扩增，并利用gltA基因序列引物对阳性样本进行验证（表 1）。取5 μl扩增产物，加入1 μl电泳载样液，1.2%琼脂糖电泳（4 V/cm）40 min，紫外灯下观察并拍照，2种引物均出现目标条带的样本为巴尔通体。

表 1 实验所用引物序列信息

表选项

利用rpoB基因序列引物扩增的阳性PCR产物（333 bp）送吉林库美生物公司直接测序，获得序列应用BLAST与GenBank中的序列进行序列比对（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）。选用Mega 6.0软件^[8]进行系统进化分析，用邻接法（neighbor-joining method，NJ）构建系统进化树。本研究采用的参考菌株序列均取自GenBank。

本次调查共捕获鼠类113只，经鉴定隶属于3科4属5种，其中黑线姬鼠（Apodemus agrarius）85只，占捕鼠总数的75.22%，为优势鼠种，其次为大林姬鼠（Apodemus peninsulae）占15.93%（18/113），花鼠（Tamias sibiricus）占6.19%（7/113），大仓鼠（Tscherskia triton）占1.77 %（2/113），东方田鼠（Microtus fortis）占0.89%（1/113）。

共检测到阳性样本69份，阳性率为61.06%（69/113）（图 1），其中黑线姬鼠阳性样本60份，阳性率为53.10%（60/113），占捕获黑线姬鼠总数的70.59%（60/85）；大林姬鼠阳性样本8份，阳性率为7.08%（8/113），占捕获大林姬鼠总数的44.44%（8/18）；在花鼠中检测到阳性样本1份，阳性率为0.88%（1/113）。

注：M. DL2000 Marker；N.阴性对照 图 1 黑龙江省同江口岸鼠类巴尔通体检测结果（rpoB基因）

图选项

通过应用GenBank中BLAST功能对所有序列进行比对发现，序列编号TJ2016-107均与分离自中国花鼠的B. washoensis（AB519122.1、AB520713.1）SR22-1株和SR25-1株同源性最高，分别为99%和98%。该阳性样本分离自1只雌性花鼠，将所测序列上传至GenBank，序列号KY072968，并对该阳性标本序列构建系统进化树，见图 2。

图 2 基于巴尔通体rpoB基因片段构建的系统进化树

图选项

本研究以巴尔通体rpoB基因引物进行检测，rpoB基因是单拷贝基因，可排除单一生物内序列变化的影响，有助于区分种内生物^[9]，通过对获得的阳性产物测序，分析比对并进化分析，从而确定所分离的巴尔通体种类。本研究首次在黑龙江省同江口岸花鼠脾脏中扩增出与B. washoensis同源性较高的rpoB基因阳性片段，这也证实了黑龙江省可能存在该种巴尔通体，此次研究为B. washoensis的进一步确认提供了有力的分子生物学证据。

1995年，B. washoensis首次分离于美国内华达州1例心脏病患者，同时，研究者在同一地区加利福尼亚黄鼠中分离到与该患者相同的B. washoensis，并且发现该种松鼠感染率高达17%以上^[4]。不仅如此，2003年，该种巴尔通体又在美国科罗拉多州1只黑尾草原犬心脏血液中检出^[10]，说明B. washoensis属于人兽共患病原体，并可能感染多种哺乳动物^[11]。

松鼠科鼠种被认为是B. washoensis天然宿主库，现已知在多种鼠种中检出该巴尔通体，包括加利福尼亚州黄鼠（北美）、瑞士黄鼠（北美）、哥伦比亚黄鼠（北美）、达乌尔黄鼠（中国）、花鼠（中国）、红松鼠（北美）、美洲飞鼠（北美）、松鼠（中国）^[12]等，均属于松鼠科，Inoue等^[12]利用多基因分析发现，B. washoensis可能与松鼠科鼠种存在特异性宿主的关系，与地理因素无关。在中国，关于B. washoensis的报道较少，2015年，宋秀平等^[13]在对内蒙古自治区小型兽类巴尔通体感染情况调查时，在达乌尔黄鼠中检测到该种巴尔通体，同年Li等^[14]在黑龙江省黑瞎子岛花鼠中也检测到该种巴尔通体，上述结果均与Inoue等^[12]的研究结论相符。

巴尔通体除常见的rpoB和gltA基因检测外，还包括16S rRNA、ftsZ、ribC和groEL基因，为了更充分证实该地区巴尔通体与其他一些相关文献所记载B. washoensis的差别与联系，应对其他基因作相应的检测，并进行序列分析，以提供更多能充分证明黑龙江省同江口岸存在B. washoensis的证据。从实验结果发现，该地区鼠类携带巴尔通体阳性率较高，研究者希望通过对所有阳性样本进行多基因检测，以便及时发现更多可能存在的不同种类的巴尔通体，以丰富黑龙江口岸病原体库，对病原体的传入传出提供有效的防控。