布鲁氏菌（Brucella）是布鲁氏菌病（布病）的病原体，是一种兼性胞内寄生的革兰阴性菌。脂多糖（LPS）位于细胞壁的最外层，是外膜的主要成分之一^[1]。脂多糖是布鲁氏菌重要的毒力因子，其不具有典型的病原体相关分子模式（PAMP）^[2-3]，致热源性弱，在布鲁氏菌逃避机体免疫应答、黏附侵袭及胞内存活等方面具有重要作用。脂多糖结构的变化可引起布鲁氏菌毒力的改变^[3-4]，根据脂多糖结构是否完整，可以将布鲁氏菌分为光滑型和粗糙型，一般认为光滑型布鲁氏菌毒力强于粗糙型^[5]。脂多糖在布病诊断以及布鲁氏菌致病机制的研究中均具有重要价值，但不同方法提取的脂多糖可能在分子质量及细微结构上有所不同，最终可能影响研究结果。目前经典的脂多糖提取方法是酚水法^[6-8]，其优点是产量大且提取的脂多糖纯度高，但操作复杂，需要的细菌量大，危险性较高。脂多糖提取试剂盒（iTron公司）是在酚水法的基础上建立的，该方法在布鲁氏菌脂多糖的提取中应用的还比较少^[9]，本研究对酚水法和试剂盒法提取布鲁氏菌脂多糖的效果进行比较，以期获得更好的提取布鲁氏菌脂多糖的方法，为布鲁氏菌脂多糖进一步的研究奠定基础。

布鲁氏菌羊种1型标准菌株16M，由中国CDC传染病预防控制所布鲁氏菌病室保存。

三胜黄素、硫瑾滤纸片、碱性复红滤纸片、噬菌体，脂多糖提取试剂盒（iTron，韩国）、脂多糖ELISA试剂盒（泉州市科诺迪生物科技有限公司）、银染试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）、考马斯亮蓝染色试剂盒及SDS凝胶试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）、脂多糖活性检测试剂盒（金斯瑞生物科技股份有限公司），其他试剂均为国产分析纯。

用布氏琼脂制备固体斜面培养基，将-80 ℃冻存菌以布氏肉汤复苏后接种于培养基上，37 ℃培养48 h。复核菌株血清型，然后用三胜黄素及吖啶黄素玻片凝集试验检测菌株表型变异情况。涉及活菌的实验操作均在生物安全三级（BSL-3）实验室进行。

取50 g布鲁氏菌溶解于170 ml无菌蒸馏水中加热灭活；然后加入190 ml 66 ℃ 90%苯酚溶液，66 ℃搅拌15 min，离心；吸取下层的酚相，加入500 ml含1%饱和醋酸钠的冷甲醇，4 ℃下沉淀2 h；弃上清，向沉淀中加入80 ml蒸馏水，搅拌18 h后离心，收集上清液；向上一步骤所得沉淀中加入80 ml蒸馏水，搅拌混匀，离心后收集上清液；向两次收集的上清液中加入8 g三氯乙酸，搅拌混匀，再次离心收集上清液，透析后即得粗提取的脂多糖；向粗提取的脂多糖溶液中加入终浓度15 μg/ml的核酸酶和蛋白酶消化，然后用去离子水透析，即得纯化的脂多糖。

取新鲜布鲁氏菌16M，悬浮于灭菌生理盐水中，调整细菌浓度至1.0×10⁹/ml，离心收集沉淀；加入1 ml裂解液，剧烈振荡。加入200 μl氯仿，振荡混匀，室温下静置5 min；4 ℃下离心。将400 μl上清液转移到新试管中，加入800 μl提纯缓冲液，充分混匀。-20 ℃下静置10 min；将溶液在4 ℃下14 000×g离心15 min，弃掉上清液；向沉淀中加入1 ml 70%乙醇，倒转试管清洗脂多糖，离心后弃上清液，室温下晾干沉淀；加入30~50 μl 10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液到脂多糖中，振荡或吹打。煮沸2 min，使脂多糖完全溶解；加入蛋白酶K处理以获得更高纯度的脂多糖。

按照聚丙烯酰胺凝胶试剂盒说明书灌制12%的分离胶和浓缩胶。将脂多糖样品取9和3 μl的4×蛋白上样缓冲液混合，煮沸5 min使脂多糖和上样缓冲液充分结合。按顺序上样，80 V电泳30 min后电压改为120 V，继续进行电泳，至溴酚蓝迁移至凝胶边缘。

按照银染试剂盒说明书进行操作。电泳结束后，取凝胶放入100 ml固定液中，在摇床上室温摇动2 h；弃固定液，加100 ml 30%乙醇，摇动10 min；弃30%乙醇，加入200 ml超纯水，摇动10 min；弃水，加入100 ml银染增敏液（1×），摇动2 min；弃原有溶液，加入200 ml超纯水，摇动1 min；弃水，再加入200 ml超纯水，摇动1 min；弃水，加入100 ml银溶液（1×），摇动10 min；弃原有溶液，加入100 ml超纯水，摇动1 min；弃水，加入100 ml银染显色液，在摇床上室温摇动3~10 min，直至出现比较理想的条带。终止：弃银染显色液，加入100 ml银染终止液（1×），在摇床上室温摇动10 min，然后弃终止液，凝胶置于读胶仪上照相。

设置标准孔、样本孔和空白孔，标准孔中各加不同浓度的标准品50 μl；各样本孔中加入待测样本50 μl；标准品孔和样本孔每孔均加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 μl，封住反应孔，37 ℃孵育60 min；洗板5次，然后每孔中加入底物A、B各50 μl，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入终止液50 μl，15 min内在450 nm处测定各孔的A值。根据A值计算样品浓度。

配制1.0、0.5、0.25、0.1 EU/ml的内毒素标准溶液；在洁净试管中分别加入100 μl标准液，样本和LAL reagent water，振荡30 s；各试管中加入100 μl LAL溶液，涡旋混匀；37 ℃加热10 min；每个试管中加入100 μl配好的染色基质，振荡混匀。37 ℃孵育6 min；每个试管中加入500 μl的终止液1，振荡混匀。然后在每个试管中加入500 μl固色液2，最后加入500 μl配好的固色液3，振荡3 s，防止产生泡沫；在545 nm下读取每个反应体系的A值。

用SAS 9.3软件对所得数据进行统计分析，两组均数之间的比较，若两组方差齐用Student t检验；若组间方差不齐，则使用调整的t′检验，以α＝0.05进行统计学检验。

以商品化的大肠埃希菌（Escherichia coli）脂多糖标准品为对照，对两种方法提取的布鲁氏菌脂多糖的银染结果进行分析。与试剂盒法比较，酚水法提取的脂多糖在17×10³及26×10³处存在明显缺失。两种方法提取的脂多糖中经考马斯亮蓝染色均未显示明显的蛋白条带，说明脂多糖纯度较高（图 1）。

注：1、5.蛋白Marker；2. 16M的脂多糖（试剂盒法）；3. 16M脂多糖（酚水法）；4.脂多糖标准品 图 1 酚水法和试剂盒法提取脂多糖结果 Figure 1 LPS extracted by phenol water method and the iTron kit

图选项

在测定脂多糖的活性之前，用ELISA法测量脂多糖浓度，将两种方法提取的脂多糖稀释到相同浓度后用鲎试剂凝集试验测量并比较脂多糖活性。酚水法和试剂盒法提取的脂多糖鲎试剂凝集活性分别为（4.926±0.051）和（5.015±0.037）EU/ng，差异无统计学意义（t′＝1.270，P＝0.332），而脂多糖标准品的凝集活性仅为（3.325±0.839）EU/ng。

脂多糖是革兰阴性菌外膜的主要成分之一，也是革兰阴性菌重要的毒力因子。常用的脂多糖提取方法有煮沸法、超声波法^[10]、酚水法以及近年来出现的脂多糖提取试剂盒法^[11]。煮沸法和超声波法只适合于粗提取，杂质较多，所提取的脂多糖难以进行下游的研究。酚水法适用于光滑型脂多糖的提取，利用脂多糖可以溶于水相，蛋白质由于酚的作用变性沉淀而被去除，同样溶于水相的核酸则通过核酸酶的消化来去除，从而得到纯度较高的脂多糖^[12-14]。该方法的优点是产量大且提取的脂多糖纯度高，但操作复杂，实验周期长。该方法通常使用50 g湿菌进行脂多糖的提取，而制备50 g布鲁氏菌具有较高的危险性，因此限制了布鲁氏菌脂多糖的研究。脂多糖提取试剂盒采用酚/水/氯仿萃取技术，该方法操作时间短，仅需要1~2 h，且用少量细菌即可以提取可观的脂多糖，操作过程可在生物安全柜中完成，安全性大为提高。

本实验对两种方法提取的布鲁氏菌脂多糖的结构及活性进行了比较，结果显示两种方法提取的脂多糖活性均较高，二者无明显差异。酚水法提取的脂多糖在17×10³及26×10³处存在条带缺失，可能因为该分子质量的脂多糖存在于水相中，而酚水法主要提取酚相中的脂多糖，试剂盒法提取的脂多糖更加完整。综上所述，试剂盒法提取布鲁氏菌的效果要优于酚水法。