广州管圆线虫病是由广州管圆线虫（Angiostrongylus cantontensis）幼虫引起的一种人兽共患寄生虫病，为我国新发传染病之一。至今约报道病例2 900余例，其中75%的病例发生在泰国、中国大陆及台湾^[1]。人类因生食或半生食含有广州管圆线虫Ⅲ期幼虫（L3）的中间宿主或转续宿主而感染，人感染后常表现为嗜酸粒细胞增多性脑膜炎或脑膜脑炎，严重感染可危及生命。PCR技术是近年来迅速发展起来的分子生物学检测技术，已广泛地应用于广州管圆线虫病的研究领域，笔者对PCR技术及以PCR技术为基础的分子生物学、分子信息学及分子蛋白检测和鉴定方法在广州管圆线虫病研究中的应用进行综述。

目前检测螺内感染期幼虫的方法，从形态学上进行判定的有肺检法、匀浆法和酶消化法，分子生物学检测方法主要有反转录PCR（RT-PCR）、PCR和实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）等。遗传标记物常用于种群遗传研究，可区分不同物种，常见标记物有核糖体DNA内转录间隔2区（Internal transcribed spacers1，ITS2）、小亚基核糖体RNA（small subunit ribosome RNA，SSU rRNA）、细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome coxidase，COⅠ）及核糖体18S rRNA基因等。Rodpai等^[2]从老挝、柬埔寨、缅甸及泰国采集的螺分离广州管圆线虫，应用PCR扩增ITS2、SSU rRNA及COⅠ基因并测序，首次成功鉴定广州管圆线虫及马来管圆线虫（A. malaysiensis），认为这3个基因可鉴定广州管圆线虫种内差异，其中COⅠ基因种内变异大，尤其适用于不同地理株多样性的鉴定。Tujan等^[3]应用类似的方法，报道菲律宾的Nueva Ecija地区鼠感染广州管圆线虫的感染率为31%，小管福寿螺（Pomacea canaliculata）和拟黑钉螺（Melanoides maculata）的感染率分别为2%和1%，给该地区带来公共安全隐患。Vitta等^[4]在泰国开展调查，通过扩增螺内线虫COⅠ基因片段，发现隐带螺（Cryptozona siamensis）为一种新发现的中间宿主。2007年美国CDC应用传统PCR法对夏威夷的软体动物开展调查，证明PCR法在检测时敏感性高，可在1 mg软体组织中查到广州管圆线虫^[5]。学者们进一步对路易斯安那州、德克萨斯州、密西西比州及佛罗里达州的软体动物开展了分子流行病学调查，提出虽然广州管圆线虫尚未大面积扩散，但仍值得关注^[6]。后续的调查也证实了夏威夷岛、佛罗里达州广泛存在广州管圆线虫的感染性中间宿主^[7-8]。Chan等^[9]应用qRT-PCR证实了澳大利亚悉尼的螺类散布大蜗牛（C. aspersum）是一种常见的广州管圆线虫的中间宿主。同时，PCR也用于溯源研究，Burns等^[10]采取PCR方法扩增出甲醛固定的非洲雌小鹰（Polihierax semitorquatus）脑组织中广州管圆线虫的DNA，证实该小鹰由于感染广州管圆线虫导致脑膜炎而死亡，推测该小鹰因被喂食来自东南亚的壁虎（Hemidactylus frenatus）导致感染。此外，有学者提出，为使研究结果具有可比性，广州管圆线虫的检测方法有待标准化，全球检测实验室最好有统一的质量控制标准，PCR有标准化的控制程序及模式^[11]。

广州管圆线虫是导致人类嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎最常见的病因，检测人类感染管圆线虫的金标准方法是分离到幼虫，目前检出率仅为2%~12%^[2]，不能满足临床病原学诊断需要。Jarvi等^[12]采用荧光定量PCR检测鼠的血及组织样本，发现鼠在不同感染时期的血液中可检测到广州管圆线虫的幼虫DNA，认为可用于有生食螺类饮食史的患者早期诊断。基于66×10³蛋白基因的mRNA测序分析具有高度的特异性^[13-14]，Eamsobhana等^[15]共检测19份人类脑脊液样本，其中临床诊断怀疑并且特异性抗体阳性患者的脑脊液10份，其他疑似样本9份，通过PCR扩增广州管圆线虫特异性66×10³蛋白基因，前10份样本中有4份为DNA检测阳性，其余的样本均为阴性。Epelboin等^[16]在诊断广州管圆线虫引起的嗜酸粒细胞增多性脑膜炎病时，分别采用RT-PCR和血清学检测方法，前者敏感性（90%）和特异性（100%）高，后者敏感性较低（60%），且可能发生假阳性，认为RT-PCR是诊断嗜酸粒细胞增多性脑膜炎的一个强有力工具。

分子信息分析也开始应用于临床诊断研究，Van De等^[17]应用PCR技术在越南鉴定1例患者眼部广州管圆线虫，通过扩增18S rRNA基因的522个碱基对序列，并与基因库中来自美国、巴西、中国、哥斯达黎加及英国的分离株比较，相似度高达99%。Eamsobhana等^{[15, 18]}调查显示，不同患者体内的广州管圆线虫遗传相似度为98.8%~99.2%，该作者认为，由于PCR的敏感性和特异性较高，临床患者有必要结合PCR方法进行诊断。值得注意的是，脑脊液中广州管圆线虫的DNA含量有波动性，可能导致PCR间断性阳性^[19]。当患者发病时间较短时，DNA的检测也可能假阴性，研究表明，患者脑脊液中病原DNA在急性期第6天仍为阴性，至第15天才检测为阳性^[20]。虽然PCR及相关技术已经广泛应用于野外软体动物感染研究，但临床诊断仍有待深入开展。

DNA序列分析方法是目前唯一能直接检测基因型变异的方法，既可发现类群的差异，又能避免因趋同进化的假象掩盖真正的亲缘关系。吕山等^[21]对已知序列（GQ398121）设计引物进行PCR扩增，获得5个不同遗传类型的线粒体基因组。其变异位点745个，均匀地分布在线粒体基因组中，为构建种内鉴别技术提供了基础。王敏和吕山^[22]利用PCR方法扩增COⅠ，根据碱基颠换和碱基转换随遗传距离增加的变化趋势判断COⅠ基因饱和度，认为该基因碱基置换未饱和。Yong等^[23]通过扩增线粒体全长，分析碱基序列、PCGs起始和终止密码子、tRNAs的四叶草结构等，鉴别马来管圆线虫及广州管圆线虫，认为线粒体基因作为分子标记，能很好地鉴别广州管圆线虫及后圆线虫。柯艳坤等^[24]利用qRT-PCR及高分辨率熔解曲线法检测广州管圆线虫Ⅲ期幼虫，检测灵敏度可达到1条幼虫，高分辨率熔解曲线法比普通PCR方法更为方便快捷，比Taq Man探针法更经济。

Eamsobhana等^[25]通过对COⅠ、SSU rRNA、ITS1、ITS2以及部分66×10³蛋白基因遗传距离的研究，来自美国夏威夷、中国、泰国的广州管圆线虫分离株具有遗传多态性。其他学者也有类似的研究^[26-29]。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）也开始应用于检测螺内感染广州管圆线虫，与传统方法比较，LAMP不需要特别的仪器，靶基因在水浴加热时即可扩增，在反应管中可看到检测结果，适合野外监测^[11]。Martin-Alonso等^[30]实验证明，形态学检出率为19.3%，而LAMP检出率为60.2%，阳性样品通过对18S rRNA和ITS1扩增和序列分析，与资料中的广州管圆线虫的序列相似性为100%。Dusitsittipon等^[31]通过扩增多位点分子标记数据（线粒体及12个DNA微卫星），构建系统发生树，将泰国不同分离株分为2大支8小支，这些不同遗传分支可能与致病性及传染性有关。由于DNA相对稳定，在分子水平进行系统发生研究具有基于表型分析研究无可比拟的优势，分析结果更加科学可靠。

生物体内数以万计的蛋白质各有其特定的一级结构和空间结构，发挥各种不同的生物学功能。在侵入机制相关研究中，Long等^[32]使用特异性引物扩增IgK的单条肽序列，插入慢病毒系统形成pEASY-T5-IMH质粒，重组体表达组织蛋白酶B相关蛋白Ac-cathB-1具有生物活性，血清中的Ac-cathB-1有助于广州管圆线虫入侵肠黏膜。宿主胃蛋白酶能激活Ac-cathB-2，有利于广州管圆线虫侵入小鼠小肠黏膜^[33]。广州管圆线虫侵入人体后，分泌和释放抑制因子阻碍宿主蛋白酶功能，有利于寄生虫在宿主体内的生存。Liu等^[34]构建了广州管圆线虫第4期幼虫的半胱氨酸重组体，能明显阻断组织蛋白酶B，大幅上调巨噬细胞与干扰素γ（IFNγ）相关的含氮氧化物产量。细胞因子在脑部炎症发展过程发挥了重要的作用，鼠类感染广州管圆线虫后，白细胞介素-33（IL-33）促进了Th2相关免疫应答，促进嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎的进程^[35]。此后，学者们发现，广州管圆线虫可溶性抗原可诱导IL-13的产生，促进巨噬细胞和星形胶质细胞表达几丁质酶类蛋白3（Chil3），对嗜酸性粒细胞具有趋化作用，这可能是广州管圆线虫感染小鼠后嗜酸性粒细胞浸润大脑的原因^[36]。小鼠感染后信使RNA（messenger RNA, mRNA）表达IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子（TNF-a）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），细胞因子显著增加，一直延续到第21天后下降^[37]。同时，下丘脑-垂体-肾上腺激素表达发生改变，脾和胸腺产生明显的免疫抑制，导致B淋巴细胞、CD₃⁺、CD₄⁺和CD₈⁺T细胞明显减少^[38]。mmu-miR-146a-5p基因与TNF-α有交互关系，mmu-miR-146a-5p转染载体抑制物可以提高TNF-α，从而影响星形胶质细胞中的Traf6基因表达^[39]。

研究表明，血清中抗原的检出率优于抗体^[40]，学者们在筛选免疫学诊断抗原研究取得一定的进展。李素丽等^[41]应用RT-PCR和T-A克隆技术在体外克隆广州管圆线虫雌虫肌蛋白-1（Ac-fmp-1）基因，分析序列结构、功能特征及编码蛋白的理化性质、结构和功能；构建Ac-fmp-1基因原核表达载体，为制备重组Ac-fmp-1蛋白并应用于广州管圆线虫病的免疫学诊断奠定基础。有学者认为，虽然广州管圆线虫与哥斯达黎加管圆线虫（A. costaricensis）有一些共同表位，广州管圆线虫的31×10³抗原具有较高的敏感性和特异性，可以筛选其中特异性好的靶蛋白用于临床诊断^[42]。Morassutti等^[43]验证了这一说法，克隆和表达了31×10³蛋白中的14-3-3、NAC、Ep31及ES中的Lec-5、Es-7，建立cDNA文库，成功提纯和分析了血清中广州管圆线虫特导性蛋白，如14-3-3、Lec5及ES7。Morassutti等^[44]在另一研究中认为，广州管圆线虫的31×10³抗原与其他寄生虫有交叉反应，应注意与其他寄生虫病的鉴别，例如颚口线虫病、弓形虫病、细粒棘球蚴病及粪类圆线虫病等，这些寄生虫病同样有嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎症状。Tsai等^[45]认为，对于感染广州管圆线虫后血脑屏障遭受严重破坏的患者，血清中的14-3-3β蛋白增加，将是一种很好的检测标志物。Vitta等^[46]克隆表达广州管圆线虫的16×10³重组蛋白，构建cDNA文库，重组体fAC40克隆（16×10³）敏感性和特异性分别为91.8%和100%，与颚口线虫和囊尾蚴无交叉反应，可应用于血清学检测广州管圆线虫感染。

血清微小RNA作为多种疾病诊断的生物标志引起人们的关注，人体感染广州管圆线虫后，微小RNA参与了基因表达的许多生物学反应。Chang等^[47]采用深度序列分析（deep-sequencing）对广州管圆线虫的微小RNA（miRNA）开展研究，并采用茎环法实时PCR（Stem-loop Real-time PCR）扩增aca-miR-1-1及aca-miR-71-1，证明这2种微小RNA在感染期幼虫至成熟过程中的基因表达急剧增加，至成虫期后下降，成虫的雄虫基因表达明显高于雌虫。广州管圆线虫的L3和L4幼虫的18miRNAs不同，其中aca-miR-29a、aca-miR-124、aca-miR-125a、aca-miR-146a、aca-miR-101及aca-miR-185具有种属特异性。采用PCR对这些特异性miRNAs进行扩增和分析，aca-miR-146a的敏感性和特异性分别达到83.0%和86.7%^[48]。同年，Li等^[49]采用RT-PCR及核酸杂交技术(Northern blot)，证实aca-miR-124和aca-miR-146a-5p在L3表达较低，但在L4表达较高。转染aca-miR-124可抑制mRNA表达IL-6、IL-1β和TNF-a，表明aca-miR-146a-5p是诊断广州管圆线虫的潜在分子标志。由此可见，生命现象需要多个基因和多种蛋白质相互协调作用，多种蛋白质研究技术也逐步应用于广州管圆线虫，有关蛋白质研究的数据库不断涌现，也逐步成为研究者交流数据、鉴定蛋白质、推测功能的重要手段，但仍远不能满足临床辅助诊断及现场防治的需要。

分子生物学技术以其灵敏度高、特异性强等优点为广州管圆线虫的虫种鉴定、临床辅助诊断及流行病学调查带来无限生机，广州管圆线虫的研究进入分子水平，从基因角度揭示物种进化、分类、亲缘关系及致病机制等的本质。但是各种分子技术在广州管圆线虫的诊断、虫种鉴定及流行病学调查应用中仍存在一定的局限性，常需要与饮食史、形态学、血清学、遗传学及生物化学等传统方法相结合共同判断和鉴别虫种。迄今为止，人体感染广州管圆线虫的早期诊断仍很不理想，从分子水平对广州管圆线虫感染的早期诊断、鉴定、物种进化、亲缘关系及种内遗传变异的本质的研究有待进一步深入。随着分子生物学技术的飞速发展，分子生物学技术在广州管圆线虫的研究将得到更广泛的应用。