蝇类是多种病媒生物疾病的潜在传播媒介，可机械性传播多种病原体，从而引起痢疾、伤寒等多种食源性疾病，是我国主要的卫生害虫。目前，我国灭蝇的主要方式为化学防治^[1]。大量使用杀虫剂可导致蝇类的抗性增加，给灭蝇工作增加难度。因此，对蝇类进行抗性监测，从而科学指导灭蝇，是减缓蝇类产生抗性的重要手段。乙酰胆碱酯酶（AChE）是昆虫神经系统中的重要酶系，也是氨基甲酸酯类农药的主要作用靶标^[2]。为了解杭州市家蝇（Musca domestica）现场种群对残杀威产生高抗的原因，通过对家蝇敏感品系与现场种群AChE水解活性及现场种群AChE对残杀威的残存活性进行测定，为研究其抗性机制提供线索。

95.56%残杀威由浙江省CDC提供；丙酮（分析纯，浙江杭州化学试剂厂生产）；pH 7.5 PBS缓冲液（0.1 mol/L），GENMED Bradford蛋白质浓度定量试剂盒、GENMED组织乙酰胆碱酯酶活性比色法定量检测试剂盒（GENMED SCIENTIFICS INC. USA）。

家蝇现场种群采集于杭州市某农贸市场附近，经鉴定后带回杭州市CDC昆虫饲养室，繁殖至第1~2代、羽化后4~5 d的雌性成蝇（体质量18~20 mg/只）供试；敏感品系由浙江省CDC病媒生物防制科提供。

微量移液器套装（法国Gilson）；酶标仪（德国Thermo）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf）；组织研磨器（德国QIAGEN）；电子天平（精度为0.001 g）。

采用点滴法^[3]。

将羽化第4天的成蝇置于-80 ℃冷冻2 h，取头部加入500 μl经4 ℃预冷的PBS缓冲液，加入3颗玻璃珠进行研磨，在振荡器中充分匀浆（振荡频率为30次/s，振荡1 min），匀浆液于4 ℃、13 300×g离心15 min，将上清液移入EP管中，冰浴保存备用。根据GENMED Bradford蛋白质浓度定量试剂盒说明书操作，绘制蛋白质浓度标准曲线，测定样品在波长595 nm处的吸光度，换算样品蛋白质含量。每个样品重复测定2次。

根据GENMED组织乙酰胆碱酯酶活性比色法定量检测试剂盒说明书操作，测定样品在波长412 nm处反应15 min的吸光度，每个样品重复测定2次，计算样品AChE活性〔μmol/（mg·min）〕。

AChE残存活性反应体系与AChE水解活性测定基本相同，仅在实验组体系内加入抑制剂残杀威，使其终浓度达0.000 5 mol/L，以PBS缓冲液为对照，在酶标仪中读取5 min。每个样品重复测定2次。残存活性计算公式：残存活性＝v_t / v_c×100%，式中v_t为药剂处理组平均反应初速度，v_c为无药剂对照组平均反应初速度，v_t与v_c均可在酶标仪中直接读取。AChE残存活性＞20%为不敏感，不敏感个体在种群中的比例达到20%即为抗性种群^[4]。

采用SPSS 20.0软件进行数据处理和统计。利用毒力回归方法计算半数致死量（LD₅₀）及其95%CI，蛋白质含量以平均数±标准差（x±s）表示。采用t检验对家蝇现场种群与敏感品系的蛋白质含量和AChE水解活性进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

家蝇敏感品系LD₅₀及其95%CI为0.155 0（0.139 5~0.172 2）μg/只，现场种群使用40%残杀威丙酮饱和溶液不能使试虫100%死亡，LD₅₀＞400 μg/只，抗性倍数＞2 500倍。

根据蛋白质定量标准曲线（y＝13.390x－7.789，r²＝0.994），每10 μl敏感品系和现场种群家蝇头部提取的蛋白量分别为（4.051±0.394）和（4.885±0.608）μg，差异有统计学意义（t＝6.909，P＜0.001）。

家蝇敏感品系和现场种群的AChE水解活性分别为（0.291±0.114）和（0.360±0.104）μmol/（mg·min），差异有统计学意义（t＝2.692，P＝0.009）。

家蝇现场种群个体的AChE残存活性最高为64.39%，最低为5.35%。对残杀威不敏感的个体（残存活性＞20%）占种群总数的38.89%（图 1）。

图 1 杭州市家蝇现场种群的残存活性分布

图选项

家蝇具有较好的环境适应能力，长期暴露于某种杀虫剂时，其种群抗性水平可迅速增加。有研究表明，用辛硫磷、DDVP、高效氯氰菊酯和溴氰菊酯等杀虫剂对家蝇自然种群进行选育后，家蝇不仅对选育使用的杀虫剂产生抗性，还对残杀威产生不同程度的交互抗性^[5-8]。目前，杭州市家蝇外环境化学防治主要使用拟除虫菊酯类药物，使家蝇对该类药物长期处于高抗水平^[9]。残杀威等氨基甲酸酯类农药在家蝇防治中的使用量并不高，但经监测发现，杭州市家蝇已普遍产生高抗性，可能因不规范使用灭蝇杀虫剂而产生交互抗性。

AChE是氨基甲酸酯类农药的主要作用靶标^[2]。袁建忠等^[10]发现AChE基因突变（V261L、G343A、F408Y和D422V等）可导致家蝇的AChE生化性质发生较大变化，从而影响其抗性表型。目前，已发现AChE基因突变可提高家蝇对乙酰胆碱的水解效率^{[2, 10]}、降低杀虫剂的敏感性等^[10-12]。本研究发现，杭州市家蝇现场种群的AChE平均水解活性明显高于敏感品系，而家蝇现场种群对残杀威已不敏感，提示杭州市现场家蝇种群的AChE的生化特性发生了较大变化，可能是导致其对残杀威产生高抗的主要原因，为其抗药性产生的分子机制研究提供了线索，但相关作用机制需进一步研究。