巴尔通体（Bartonella）是世界广泛分布的革兰阴性、营养条件要求苛刻的兼性细胞内寄生需氧杆菌。其通过吸血节肢动物（如蚤、蜱和虱等）在脊椎动物间传播^[1]。目前，全世界已报道巴尔通体达30余种和一些未定种，截至2009年已有13种为人致病菌，主要有杆菌状巴尔通体（B. bacilliformis）、五日热巴尔通体（B. quintana）、汉赛巴尔通体（B. henselae）、伊丽莎白巴尔通体（B. elizabethae）、克氏巴尔通体（B. clarridgeiae）、格拉范姆巴尔通体（B. grahamii）和文氏巴尔通体的2个亚种（B. vinsonii subsp. berkhoffii、B. vinsonii subsp. arupensis）等，可引起人类卡里翁病、战壕热、猫抓病、心内膜炎、杆菌性血管瘤和肝脾肉芽肿等，临床表现复杂多样，几乎危及全身各个器官和系统^[2]。

近年来，国内有报道从鼠、蚤和蜱中分离到巴尔通体，从临床患者血液中检测到巴尔通体已超过12种^[3]。中国-哈萨克斯坦（中哈）边境阿拉山口口岸是第二座亚欧大陆桥中国段西部的桥头堡，该区物种丰富，小型哺乳动物和病媒生物种类不断被发现，截至2008年已报道蚤类5科12属22种^[4]，蜱类达8种之多^[5]，但主要传播媒介是否携带巴尔通体不详，存在疫情的跨境传播和潜在隐患，不利于风险预警。因此，应对该地区的主要传播媒介蚤、蜱类进行巴尔通体病原体分子流行病学调查。本研究采用PCR检测中哈边境阿拉山口口岸通道、城、郊、野外及边境线区鼠体表蚤和游离蜱的巴尔通体携带及分布情况，现将结果报告如下。

于2016年1－9月，在中哈边境阿拉山口口岸出入境通道、城、郊、野外及边境线5个监测区捕获鼠类并采集其体表寄生蚤，按不同宿主分装于含70%乙醇瓶中；2016年5－9月，在中哈边境火车站和艾比湖沿岸边采集游离蜱，带回实验室进行分类鉴定和计数并登记，待检。

将蚤按不同种、雌、雄、宿主和采集区域，以每个无菌EP管放入2~15匹、蜱单只单管进行分装。采用不同溶液（90%、70%、50%、30%乙醇、无菌蒸馏水）依次清洗30 min，后取出放置于无菌滤纸吸取多余无菌蒸馏水。最后置于无菌EP管中，按DNA提取试剂盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕说明书提取蚤基因组DNA，置-20 ℃保存备用。

反应体系25 μl：模板DNA加2 μl，12.5 μl Pcr mix（广州东盛生物科技有限公司），引物1 μl，加去离子水至25 μl，反应用引物及循环参数见表 1。取2.5 μl扩增产物至1.5%琼脂糖凝胶进行电泳至凝胶2/3处，利用凝胶成像系统观察并拍照。为避免标本污染引起假阳性反应，标本处理、反应液制备、PCR扩增及产物分析分别在不同区域进行，加样移液器分开专用，PCR同时设立空白对照（去离子水）及阳性对照〔前期PCR在臀突客蚤（Xenopsylla minax）上检测到的阳性样本〕。

表 1 PCR反应条件 Table 1 The PCR reaction conditions

表选项

选取阳性样本送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果录入GenBank进行Blast分析，利用Mega 6.0软件构建遗传进化树。

共捕获鼠类1科2属3种111只，分别为大沙鼠（Rhombomys opimus）102只、柽柳沙鼠（Meriones tamariscinus）3只和红尾沙鼠（M. erythrourus）6只，大沙鼠为优势种，主要分布在城郊、野外及边境线区。在鼠体表采集蚤类2 139匹，经鉴定隶属于6属7种，其中臀突客蚤是该地区的优势蚤种，占总蚤数的73.59%（1 574/2 139），主要宿主为大沙鼠，也是其他野栖和家栖多种鼠类的寄生蚤；叶状切唇蚤突高亚种（Coptopsylla lamellifer ardua）、后弯怪蚤（Paradoxopsyllus repandus）和秃病蚤指名亚种〔Nosopsyllus（Gerbillophilus）laeviceps laeviceps）〕分别为66、209和80匹，也以大沙鼠为主要宿主，并寄生于柽柳沙鼠和红尾沙鼠；长吻角头蚤（Echidnophaga oschanini）121匹，是大沙鼠等多种鼠形动物的寄生蚤；同型客蚤指名亚种（Xenopsylla conformis conformis）77匹，主要宿主为红尾沙鼠；宽臂纤蚤（Rhadinopsylla cedestis）12匹，主要宿主为柽柳沙鼠，见表 2。采集游离蜱243只，经鉴定全部为亚洲璃眼蜱（Hyalomma asiaticom）。

表 2 中哈边境阿拉山口地区鼠类体表染蚤情况 Table 2 Alashankou China⁃Kazakhstan border region rats body catch fleas

表选项

将全部蚤分为199组，按同种、同点2~15匹/组分装于无菌EP管中分批逐一进行研磨和核酸提取。243只蜱每只均经消毒、研磨、核酸提取后，利用引物BhCS.781p-BhCS.1137n、Bh.311p-Bh.452n和ribC-BARTON-F-ribC-BARTON-R进行PCR，分别扩增出巴尔通体gltA约379 bp、16S~23S rRNA基因间隔区（intergenic spacer，ITS）5′ -末端约200 bp和ribC（riboflavin synthase gene）约588 bp片段。经测序得到3株不同的巴尔通体，DNAman比对分析3株巴尔通体的同源性分别为93.61%、52.54%和86.72%（图 1）。

注：M. DNA分子质量标准；+.阳性对照；－.阴性对照；其他泳道为部分样本PCR结果 图 1 巴尔通体gltA、ITS和ribC基因PCR扩增结果 Figure 1 The PCR amplification of gltA, ITS, ribC genes

图选项

仅臀突客蚤、叶状切唇蚤突高亚种和后弯怪蚤中检出巴尔通体阳性。大沙鼠体表的臀突客蚤、叶状切唇蚤突高亚种和后弯怪蚤巴尔通体阳性率分别为66.67%（68/102）、70.83%（17/24）和72.73%（24/33）；柽柳沙鼠体表臀突客蚤和后弯怪蚤巴尔通体阳性率分别为36.36%（4/11）和50.00%（1/2）；红尾沙鼠体表臀突客蚤巴尔通体阳性率为33.33%（2/6）。其他蚤和全部亚洲璃眼蜱均未检出巴尔通体阳性片段。

Blast比对分析发现，Bartonella-1、Bartonella-2和Bartonella-3与前期在阿拉山口地区检测的Bartonella sp. AL01（KX572889、KX572893、KX572897）、02（KX572890、KX572894、KX572898）和04（KX572892、KX572896、KX572900）同源性均达100%；与B. rochalimae、B. grahamii和B. elizabethae的同源性分别为97.22%~98.89%、93.73%~98.68%和92.65%~100%，分别与B. rochalimae、B. grahamii和B. elizabethae聚为一支，见图 2。

图 2 基于gltA-ITS-ribC基因构建的分子遗传进化树 Figure 2 Phylogenetic tree based on gltA-ITS-ribC gene of Bartonella

图选项

巴尔通体为人兽共患性病媒生物性传播疾病的病原体，其培养困难，菌落表型无明显特异性，主要依靠以PCR为基础的分子生物学技术及血清学方法进行检测鉴别。同时，该病原体地理分布广泛，受世界各地关注，尤其是蚤、白蛉、体虱和蜱等传播媒介的相关研究已引起广泛关注，在美国、法国、秘鲁、荷兰和意大利等国家均有报道应用PCR法扩增出蚤、蜱的巴尔通体基因^[6]。栗冬梅等^[7]采用PCR法证实猫栉首蚤（Ctenocephalides felis）和缓慢细蚤（Leptopsylla segnis）可感染巴尔通体，并在猫栉首蚤和微小牛蜱（Boophilus microplus）中分离培养出巴尔通体，为蚤、蜱作为巴尔通体传播媒介提供了线索。

本研究应用3对巴尔通体特异性引物对蚤类样本进行PCR，结果显示，中哈边境阿拉山口地区臀突客蚤、叶状切唇蚤突高亚种和后弯怪蚤中均扩增出巴尔通体阳性条带，经测序发现，3种巴尔通体均有致病性，尤其在臀突客蚤中检测到2种致病巴尔通体且具有极高的阳性率。臀突客蚤不仅可以寄生在野栖鼠体表，也可寄生于家栖鼠〔如褐家鼠（Rattus norvegicus）〕 ^[8]。该蚤可叮咬人吸血，其在宿主中的交换转移及叮吸人血的习性可能增加人群感染的风险，应引起高度关注^[9]。本研究虽证实3种蚤类均携带巴尔通体，但对其潜在风险和传播作用应进行流行病学和传播实验等研究。亚洲璃眼蜱虽未检测到巴尔通体阳性核酸，但作为该区域的优势蜱种，其携带病原体的潜在风险仍不能忽视。

随着国家“一带一路”战略的深入和持续发展，阿拉山口口岸地区是中哈两国的必经要道，两国边境除铁丝网外无自然屏障，该地区的啮齿动物及体表蚤、蜱等媒介生物可随宿主动物通过铁丝网自由地跨入窜出。同时，各类交通工具、货物及贸易的流通为多种媒介生物的传入提供了便利。因此，应高度关注和加强对中哈边境地区巴尔通体等病原体的检测，为防止其传入传出提供风险预警和依据。